Моделирование туберкулеза Mycobacterium marinum инфицированных взрослых рыбок данио
Summary
Здесь мы представляем протокол к модели людских туберкулезом в взрослых рыбок данио, используя свой естественный возбудитель Mycobacterium marinum. Извлечения ДНК и РНК от внутренних органов зараженных данио рерио может использоваться для показывают, что всего микобактериальной загружает в рыбы и хозяина иммунной реакции с ПЦР.
Abstract
Микобактерии туберкулеза в настоящее время смертоносных человеческий патоген, вызывая 1,7 миллиона смертей и 10,4 миллиона инфекций каждый год. Воздействие эта бактерия вызывает широкий болезни спектра в организме человека, начиная от стерилизованные инфекции активно прогрессирующей смертельной болезни. Наиболее распространенной формой является латентный туберкулез, который протекает бессимптомно, но имеет потенциал, чтобы активировать в молниеносный заболевание. Взрослый данио рерио и его природного патогена Mycobacterium marinum недавно оказались применимыми модель для изучения заболевание широкий спектр туберкулеза. Важно отметить, что спонтанное задержки и возобновления, а также адаптивного иммунного ответа в контексте микобактериальной инфекции могут быть изучены в этой модели. В этой статье мы описываем методы для экспериментальной инфекции взрослых рыбок данио, коллекции внутренних органов для извлечения нуклеиновых кислот для измерения микобактериальной нагрузок и принимающих иммунные реакции путем количественного PCR. В-дом-развитых, м. marinum –конкретного ПЦР анализа более чувствительны, чем традиционных покрытий методами, как он также обнаруживает ДНК от-деления, спящие или недавно мертвых микобактерий. Как ДНК и РНК извлекаются из того же лица, это возможно для изучения взаимосвязи между состояние больного и хозяин и возбудителя экспрессии генов. Взрослый zebrafish модель для туберкулеза таким образом позиционирует себя как очень применимо, не млекопитающих в естественных условиях системы для изучения взаимодействия хост патогена.
Introduction
Данио рерио (Danio рерио) широко используется модель животных в биомедицинских исследованиях и это принятой модели для общей биологии позвоночных. Данио рерио была адаптирована для многих областях исследований, моделирования человеческих заболеваний и расстройств, начиная от1 рак и болезни сердца2 инфекции и иммунологических исследований ряда бактериальных 3 и вирусных инфекций4 , 5. Кроме того, бывший внутриутробное развитие зародышей данио рерио сделал данио рерио популярная модель в биологии развития6 и токсикологии7,,8.
Во многих областях исследований, включая инфекции биологии оптически прозрачные данио рерио личинки обычно используются. Первый иммунные клетки появляются в течение 24 ч пост оплодотворение (hpf), когда примитивные макрофаги обнаружены9. Нейтрофилы являются следующий иммунные клетки появляться около 33 hpf10. Данио рерио личинки таким образом целесообразно для изучения на ранних стадиях инфекции и роль врожденного иммунитета при отсутствии адаптивных иммунные клетки11. Однако взрослые данио рерио с ее полностью функциональный адаптивной иммунной системы обеспечивает дополнительный уровень сложности для инфекции экспериментов. Т-клетки могут быть обнаружены вокруг 3 дней после оплодотворения12, и B клетки способны производить функциональных антител 4 недели поста оплодотворение13. Взрослый данио рерио обладает всеми основными партнерами врожденного и адаптивного иммунной системе млекопитающих. Основные различия между immune systems рыбы и люди находятся в антитела изотипов, а также Анатомия лимфоидной ткани. Данио рерио имеет только три антитела классов14, тогда как люди имеют пять15. В отсутствие лимфатических узлов и костного мозга первичных лимфоидных органов рыб являются почки и тимуса16 и селезенка, почки и кишечник служат в качестве вторичных лимфоидных органов17. Несмотря на эти различия, с его полной иммунной Арсенал врожденного и адаптивного клеток взрослых рыбок данио — весьма возможно, easy-to-use, не млекопитающих модель для исследования взаимодействия хост патогена.
Данио рерио в последнее время был создан как возможно модель для изучения туберкулеза18,19,20,21,22. Бортовых заболевание, вызываемое микобактериями туберкулезаявляется туберкулез. По данным Всемирной организации здравоохранения туберкулеза умерли1,7 миллионов в 2016 году и является ведущей причиной смерти во всем мире один возбудитель23. Мышей24,25, кроликов26 и27 нечеловеческих приматов являются наиболее известных животных моделей исследования туберкулеза, но каждое лицо их ограничения. Нечеловеческих приматов модель микобактерий инфекции напоминает человеческие заболевания наиболее тесно, но с помощью этой модели ограничена из-за серьезных этических соображений. Другие животные модели препятствуют хост специфика микобактерий туберкулеза , которая влияет на заболевания патология. Вероятно, самая большая проблема в моделировании туберкулеза является широкий спектр инфекции и болезни результатов в заболеваний человека: туберкулез является болезнью весьма неоднородной, начиная от стерилизации иммунитет к скрытой, активных и возобновленные инфекции28 , который может быть трудно воспроизвести и модель экспериментально.
Mycobacterium marinum является близким родственником микобактерий туберкулеза с ~ 3000 orthologous белки с 85% аминокислот личность29. М. marinum естественно заражает данио рерио, производство гранулемы, признаки туберкулеза, в его внутренних органов19,30. В отличие от других животных моделей, используемых в исследованиях туберкулеза данио рерио производит много потомства, он требует только ограниченное пространство и главное, это neurophysiologically наименее развитых позвоночных туберкулезом модель доступна. Кроме того м. marinum инфекция вызывает латентной инфекции, активной болезни или даже стерилизации микобактериальной инфекции в взрослых рыбок данио, тесно имитирует спектр заболеваний результаты человека туберкулезом19, 31 , 32. здесь, мы описываем методы для экспериментальной туберкулезом модель взрослых рыбок данио путем впрыскивать marinum м. в брюшной полости и количественного PCR для измерения микобактериальной нагрузок и иммунные реакции от данио рерио образцы тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем ПЦР-приложения на основе измерения микобактериальной нагрузок от ДНК, извлеченные из экспериментально зараженных взрослых рыбок данио тканей. Это приложение основано на грунты, построена вокруг 16S-23S рРНК внутренней трансляции распорку последовательности…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа оказывает поддержку путем финский культурный фонд (H.L.), Тампере туберкулезом Foundation (H.L., л-м.в., M.M.H., м.п.), Фонд финской ассоциации борьбы с туберкулезом (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H., м.п.), Зигрид Jusélius фонда (м.п.), Эмиля Аалтонена фонда (M.M.H.), Джейн и Aatos Эркко фонда (м.п.) и Академия Финляндии (м.п.). Leena Мякинен, Ханна-Леена Piippo и Дженна Ilomäki признаны за их технической помощи. Авторы признают Тампере данио рерио лаборатории для их обслуживания.
Materials
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| Middlebrock OADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
| Middlebrock ADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| GENESYS20 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| 27G needle | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
| 1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Omnican 100 30G insulin needle | Braun | 9151133 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 1.5 ml homogenization tube | Qiagen | 13119-1000 | |
| 2.8 mm ceramic beads | Qiagen | 13114-325 | |
| Ethanol, ETAX Aa | Altia | ||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Chloroform | VWR | 22711.290 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118.2 g/mol |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 1613859 | FW 294.1 g/mol |
| Tris (free base) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121.14 g/mol |
| TRI reagent | Molecular Research Center | TR118 | Guanidine thiocyanate-phenol solution |
| PowerLyzer24 homogenizator | Qiagen | ||
| Sonicator m08 | Finnsonic | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
| qPCR 96-well plate | BioRad | HSP9601 | |
| Optically transparent film | BioRad | MSB1001 | |
| C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system | BioRad | ||
| RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 10666421 | decontamination reagent eliminating RNases |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Fluidigm | 100-6298 | |
| SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |
Referencias
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80 (2015).
- Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research. Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).
- Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. Studying the immune response to human viral infections using zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).
- Thisse, C., Zon, L. I. Organogenesis–heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science. 295 (5554), 457-462 (2002).
- Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).
- Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
- Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model. Frontiers in Immunology. 8, 1703 (2017).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
- Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates. Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).
- Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).
- Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A. Ontogeny of the immune system of fish. Fish & shellfish. 20 (2), 126-136 (2006).
- Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish. PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).
- Tobin, D. M., et al. Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections. Cell. 148 (3), 434-446 (2012).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Berg, R. D., Ramakrishnan, L. Insights into tuberculosis from the zebrafish model. Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).
- Ordonez, A. A., et al. Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).
- Kramnik, I., Beamer, G. Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies. Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).
- Manabe, Y. C., et al. The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome. Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).
- Pena, J. C., Ho, W. Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned. Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).
- Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 691-702 (2017).
- Stinear, T. P., et al. Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).
- Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity. Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).
- Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
- Luukinen, H., et al. Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
- Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).
- Madigan, M., Martinko, J. . Brock Biology of Microorganisms. , (2016).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish:a practical approach. , (2002).
- Vanhauwaert, S., et al. Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies. Plos One. 9 (10), e109091 (2014).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
- Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).
- Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S. Macrophage immunoregulatory pathways in tuberculosis. Seminars in immunology. 26 (6), 471-485 (2014).
- Vynnycky, E., Fine, P. The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection. Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).
- Cobat, A., et al. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).
- Delogu, G., Goletti, D. The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics. Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).
- Abel, L., et al. Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives. Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75 (2018).
- Guryev, V., et al. Genetic variation in the zebrafish. Genome research. 16 (4), 491-497 (2006).
- Brown, K. H., et al. Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).
