Modelagem de tuberculose no Zebrafish adulto infectado de Mycobacterium marinum

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para tuberculose humana de modelo em um adulto zebrafish usando seu patógeno natural Mycobacterium marinum. Extraído DNA e RNA de órgãos internos de zebrafish infectado podem ser usado para revelar que o total micobacteriana carrega no peixe e as respostas de imune do hospedeiro com qPCR.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis é atualmente o mais mortífero patógeno humano causando infecções 10,4 milhões e 1,7 milhões de mortes todos os anos. Exposição a esta bactéria faz com que um espectro largo de doença em seres humanos, que vão desde uma infecção esterilizada para uma doença mortal ativamente progredindo. A forma mais comum é a tuberculose latente, que é assintomática, mas tem o potencial para reativar a uma doença fulminante. Zebrafish adulto e seu patógeno natural Mycobacterium marinum recentemente provaram para ser um modelo aplicável para estudar o espectro de doença ampla de tuberculose. Importante, espontânea latência e reativação, bem como adaptáveis respostas imunes no contexto da infecção micobacteriana pode ser estudadas neste modelo. Neste artigo, descrevemos os métodos para a infecção experimental de zebrafish adulto, a coleção dos órgãos internos para a extração de ácidos nucleicos para a medição das cargas micobacterianas e acolhimento respostas imunes por PCR quantitativo. O in desenvolvido internamente, M. marinum –ensaio de qPCR específico é mais sensível que os métodos tradicionais de chapeamento como também detecta DNA de micobactérias não-dividindo, dormentes ou recentemente mortas. Como o DNA e o RNA são extraídos do mesmo indivíduo, é possível estudar as relações entre o estado doente e a expressão do gene hospedeiro e patógeno. O modelo adulto zebrafish para tuberculose, portanto, apresenta-se como um sistema altamente aplicável, não-mamíferos na vivo para estudar interações patógeno-hospedeiro.

Introduction

Peixe-zebra (Danio rerio) é um modelo animal amplamente utilizado na investigação biomédica e é um modelo aceito para a biologia de vertebrados comum. O zebrafish foi adaptada a muitos campos de pesquisa modelagem de doenças humanas e desordens que variam de câncer¹ e doença cardíaca² a infecção e estudos imunológicos de várias bactérias ³ e infecções virais^{4 , 5}. Além disso, o ex utero desenvolvimento de embriões de zebrafish fez o zebrafish um modelo popular em biologia do desenvolvimento-⁶ e toxicologia^7,8.

Em muitos campos de investigação, incluindo a biologia da infecção, as larvas de zebrafish opticamente transparente são comumente usadas. As primeiras células imunes aparecem dentro fertilização post de 24 h (hpf), quando os macrófagos primitivos são detectados⁹. Os neutrófilos são as células imunitárias próximo a aparecer por volta de 33 hpf¹⁰. Zebrafish larvas são, portanto, viáveis para o estudo da fase inicial da infecção e o papel da imunidade inata na ausência de células do sistema imune adaptativo¹¹. No entanto, o zebrafish adulto com seu totalmente funcional sistema imune adaptativo fornece uma camada adicional de complexidade para experimentos de infecção. Células T podem ser detectadas em torno de 3 dias pós fertilização¹², e as células B são capazes de produzir anticorpos funcionais por 4 semanas pós fertilização¹³. O peixe-zebra adulto tem todas as principais contrapartes do mamífero sistema imune inato e adaptativo. As principais diferenças entre o immune systems de peixe e os seres humanos são encontradas no anticorpo isotipos, bem como a anatomia dos tecidos linfoides. O peixe-zebra tem anticorpo apenas três classes¹⁴, Considerando que os seres humanos têm cinco¹⁵. Na ausência de medula óssea e gânglios linfáticos, os órgãos linfoides primários no peixe são o rim e o Timo¹⁶ e o baço, o rim e o intestino servem como órgãos linfoides secundários¹⁷. Apesar dessas diferenças, com seu arsenal completo imune das células inatas e adaptativas, o zebrafish adulto é um modelo altamente aplicável, fácil de usar, não-mamíferos para estudos de interação patógeno-hospedeiro.

O zebrafish ultimamente foi estabelecido como um modelo viável de estudar tuberculose^{18,19,20,21,22}. A tuberculose é uma doença no ar, causada pelo Mycobacterium tuberculosis. De acordo com a Organização Mundial de saúde, tuberculose causou1,7 milhões de mortes em 2016 e é a principal causa de morte por um patógeno único no mundo²³. Os ratos^24,25, coelhos²⁶ e primatas não-humanos²⁷ são que o animal mais conhecido modelos na pesquisa de tuberculose, mas cada rosto suas limitações. O modelo de primatas não humanos de M. tuberculosis infecção da doença humana assemelha-se mais intimamente, mas usar este modelo é limitado devido a considerações éticas graves. Outros modelos animais são prejudicados pela anfitrião-especificidade de M. tuberculosis que afeta a patologia da doença. Provavelmente o maior problema na modelagem de tuberculose é o amplo espectro de infecção e doença resultados na doença humana: a tuberculose é uma doença muito heterogênea, variando de esterilização imunidade a infecção latente, ativa e reativada²⁸ , que pode ser difícil de reproduzir e modelo experimentalmente.

Mycobacterium marinum é um parente próximo do M. tuberculosis com proteínas de ortólogos ~ 3.000 com 85% de identidade de aminoácidos²⁹. M. marinum naturalmente infecta zebrafish produzir granulomas, as principais características da tuberculose, em seus órgãos internos^19,30. Ao contrário de outros modelos animais utilizados na pesquisa de tuberculose, zebrafish produz muitos filhos, requer apenas um espaço limitado e importante, neurophysiologically é o modelo de tuberculose vertebrados menos desenvolvido disponível. Além disso, a M. marinum infecção causa infecção latente, doença ativa ou mesmo esterilização da infecção micobacteriana no zebrafish adulto intimamente imitando o espectro dos resultados de doença da tuberculose humana^{19, 31 , 32}. aqui, descrevemos os métodos para o modelo experimental de tuberculose de adultos do zebrafish injetando M. marinum na cavidade abdominal e usando PCR quantitativo para medir a cargas micobacterianas e respostas imunes de zebrafish amostras de tecido.

Protocol

Todos os experimentos de zebrafish foram aprovados pelo Conselho de experimento Animal na Finlândia (ESAVI/8245/04.10.07/2015). Métodos são executados de acordo com a lei (497/2013) e do Decreto do governo (564/2013), relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos ou educacionais na Finlândia. 1. cultivo de Mycobacterium marinum Nota: Desde que o Mycobacterium marinum é um patógeno capaz de causar infecções superficiais nos sere…

Representative Results

O patógeno de peixe natural Mycobacterium marinum infecta os órgãos internos do peixe-zebra e produz uma infecção sistêmica com granulomas histologicamente visível19. Zebrafish adulto estão infectados com M. marinum por uma injeção intraperitoneal. O DNA e RNA são extraídos, e a carga de micobactérias é medida pela reacção em cadeia do polymerase quantitativa (qPCR) usando o DNA como o modelo. O contorno do método é mostrado na <…

Discussion

Aqui nós descrevemos uma aplicação baseada em qPCR para medir micobacterianas cargas de DNA extraído de tecidos de zebrafish adultos infectados experimentalmente. Este aplicativo é baseado em cartilhas projetadas em torno do 16S-23S rRNA espaçador transcrito interno sequência⁴⁰. A carga total de micobactérias em uma amostra de peixes é estimada usando uma curva padrão preparada a partir de DNA extraído de um número conhecido de micobactérias culturas e assumindo que uma bactéria tem …

Materials

Mycobacterium marinum	American Type Culture Collection	ATCC 927
Middlebrock 7H10 agar	BD, Thermo Fisher Scientific	11799042
Middlebrock OADC enrichment	BD, Thermo Fisher Scientific	11718173
Middlebrock 7H9 medium	BD, Thermo Fisher Scientific	11753473
Middlebrock ADC enrichment	BD, Thermo Fisher Scientific	11718173
Tween 80	Sigma-Aldrich	P1754
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516-500ML
GENESYS20 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
Phosphate buffered saline tablets (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB
Phenol red	Sigma-Aldrich	P3532
27G needle	Henke Sass Wolf	4710004020
1 ml syringe	Henke Sass Wolf	4010.200V0
Omnican 100 30G insulin needle	Braun	9151133
3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0)	Sigma-Aldrich	A5040
1.5 ml homogenization tube	Qiagen	13119-1000
2.8 mm ceramic beads	Qiagen	13114-325
Ethanol, ETAX Aa	Altia
2-propanol	Sigma-Aldrich	278475
Chloroform	VWR	22711.290
Guanidine thiocyanate	Sigma-Aldrich	G9277	FW 118.2 g/mol
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	1613859	FW 294.1 g/mol
Tris (free base)	Sigma-Aldrich	TRIS-RO	FW 121.14 g/mol
TRI reagent	Molecular Research Center	TR118	Guanidine thiocyanate-phenol solution
PowerLyzer24 homogenizator	Qiagen
Sonicator m08	Finnsonic
Nanodrop 2000	Thermo Fisher Scientific
SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix	Bioline	BIO-98005
qPCR 96-well plate	BioRad	HSP9601
Optically transparent film	BioRad	MSB1001
C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system	BioRad
RNase AWAY	Thermo Fisher Scientific	10666421	decontamination reagent eliminating RNases
DNase I	Thermo Fisher Scientific	EN0525
Reverse Transcription Master Mix	Fluidigm	100-6298
SsoFast Eva Green master mix	BioRad	172-5211