Modélisation de la tuberculose chez Mycobacterium marinum adultes infectés poisson zèbre
Summary
Nous présentons ici un protocole à la tuberculose humaine de modèle dans un poisson-zèbre adulte à l’aide de son naturel pathogène Mycobacterium marinum. Extraits ADN et l’ARN des organes internes du poisson-zèbre infecté peuvent servir à révéler que le total mycobactériens charge dans le poisson et les réponses immunitaires de l’hôte avec le qPCR.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis est actuellement la plus meurtrière pathogène humain causant des infections 10,4 millions et 1,7 millions de décès chaque année. L’exposition à cette bactérie provoque un spectre large de la maladie chez les humains, allant d’une infection stérilisée à une maladie mortelle activement progresse. La forme la plus courante est la tuberculose latente, qui est asymptomatique, mais a le potentiel pour réactiver en une maladie fulminante. Poisson zèbre adulte et son naturel pathogène Mycobacterium marinum ont récemment prouvé un modèle il y a lieu d’étudier le spectre large de la maladie de la tuberculose. Ce qui est important, latence spontanée et réactivation ainsi que des réponses immunitaires adaptatives dans le cadre des infections à mycobactéries peuvent être étudiées dans ce modèle. Dans cet article, nous décrivons des méthodes pour l’infection expérimentale de poisson-zèbre adulte, la collection des organes internes pour l’extraction des acides nucléiques pour la mesure des charges mycobactériennes et réponses immunitaires hôte par PCR quantitative. L’in-house-développé, M. marinum –essai de qPCR spécifique est plus sensible que les méthodes traditionnelles de placage car il détecte également les ADN des mycobactéries non-divisant, dormants ou morts récemment. Comme l’ADN et l’ARN sont extraites de la même personne, il est possible d’étudier les relations entre l’état du malade et l’expression génique hôte et du pathogène. Le modèle de poisson-zèbre adulte pour la tuberculose se présente donc comme un système hautement applicable non mammifères in vivo pour étudier les interactions hôte-pathogène.
Introduction
Poisson zèbre (Danio rerio) est un modèle animal largement utilisé dans la recherche biomédicale et c’est un modèle accepté pour la biologie des vertébrés commun. Le poisson-zèbre a été adapté à de nombreux domaines de recherche modélisation des maladies humaines et troubles allant du cancer1 et2 de la maladie cardiaque aux maladies infectieuses et immunologiques de plusieurs bactéries 3 et infections virales4 , 5. en outre, le développement ex utero des embryons de poisson-zèbre a rendu le poisson-zèbre un modèle populaire en biologie du développement6 et toxicologie7,8.
Dans de nombreux domaines de recherche, y compris la biologie de l’infection, les larves de poisson zèbre optiquement transparent sont couramment utilisés. Les premières cellules immunitaires apparaissent dans les 24 h après la fécondation (hpf), lorsque les macrophages primitifs sont détectés9. Les neutrophiles sont les cellules immunitaires prochaines à apparaître environ 33 hpf10. Les larves de poisson zèbre sont donc réalisables pour étudier les premiers stades de l’infection et le rôle de l’immunité innée en l’absence de cellules immunitaires adaptatives11. Cependant, le poisson-zèbre adult avec ses entièrement fonctionnelle du système immunitaire adaptatif fournit une couche supplémentaire de complexité pour les expériences d’infection. Les lymphocytes T peuvent être détectées autour de 3 jours après la fécondation,12, et les cellules B sont capables de produire des anticorps fonctionnels par 4 semaines après la fécondation13. Le poisson-zèbre adult a tous les principaux homologues du système immunitaire inné et adaptatif chez les mammifères. Les principales différences entre les immune systems de poissons et les humains sont trouvent dans les isotypes d’anticorps ainsi que dans l’anatomie des tissus lymphoïdes. Le poisson-zèbre a anticorps seulement trois classes14, alors que les humains ont cinq15. En l’absence de la moelle osseuse et les ganglions lymphatiques, les organes lymphoïdes primaires chez les poissons sont les reins et le thymus16 et la rate, le rein et l’intestin servent dans les organes lymphoïdes secondaires17. Malgré ces différences, avec son arsenal complet immunitaire des cellules innées et adaptatives, le poisson-zèbre adult est un modèle très applicable, facile à utiliser, non-mammifère pour les études sur les interactions hôte-pathogène.
Le poisson-zèbre a dernièrement été créé comme un modèle possible d’étudier la tuberculose18,19,20,21,22. La tuberculose est une maladie aéroportée causée par Mycobacterium tuberculosis. Selon l’Organisation mondiale de la santé, la tuberculose due à1,7 million de décès en 2016 et est la principale cause de décès par un pathogène unique dans le monde entier23. Souris24,25, les lapins26 et les primates non humains,27 sont que des modèles l’animal plus connu dans la recherche de la tuberculose mais chaque visage leurs limites. Le modèle primate non humain de M. tuberculosis infection ressemble à la maladie humaine plus étroitement, mais à l’aide de ce modèle est limité en raison de considérations éthiques graves. Autres modèles animaux sont entravés par la spécificité de l’hôte de M. tuberculosis qui influe sur la pathologie de la maladie. Probablement le plus gros problème dans la modélisation de la tuberculose est la gamme large des résultats infection et la maladie dans la maladie humaine : la tuberculose est une maladie très hétérogène, allant de la stérilisation immunité aux infections latentes, active et réactivées28 , qui peut être difficile à reproduire et à modeler de façon expérimentale.
Mycobacterium marinum est un proche parent de M. tuberculosis avec protéines orthologues ~ 3 000 avec 85 % d’acides aminés identité29. M. marinum infecte naturellement le poisson-zèbre, produisant des granulomes, les maîtres mots de la tuberculose, dans ses organes internes19,30. Contrairement à d’autres modèles animaux utilisés en recherche de la tuberculose, zebrafish produit beaucoup de progéniture, il nécessite seulement un espace limité et surtout, il est neurophysiologically le modèle de la tuberculose vertébrés moins avancé disponible. En outre, l’infection de M. marinum provoque une infection latente, une maladie active ou même stérilisation des infections à mycobactéries chez le poisson zèbre adulte, étroitement imitant le spectre des issues des maladies de la tuberculose humaine19, 31 , 32. nous décrivons ici les méthodes pour le modèle de la tuberculose expérimentale du poisson-zèbre adulte en injectant M. marinum dans la cavité abdominale et à l’aide de la PCR quantitative pour mesurer les charges mycobactériennes et les réponses immunitaires de poisson-zèbre échantillons de tissus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici une application qPCR pour mesurer les charges mycobactériennes de l’ADN extrait de tissus de poisson-zèbre adultes infectés expérimentalement. Cette application est issue des amorces conçues autour de la 16 s-23 s rRNA espaceur interne transcrit séquence40. La charge totale de mycobactéries dans un échantillon de poisson est estimée à l’aide d’une courbe d’étalonnage préparée à partir d’ADN extrait un nombre connu de mycobactéries cultivées et en suppo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le finlandais culturel Fondation (H.L.), Tampere tuberculose Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., député), Fondation de l’Association finlandaise de lutte contre la tuberculose (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (Chambre des lords, M.M.H., député), Sigrid Jusélius Foundation (M.P), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H.), Jane et Aatos Erkko Foundation (M.P) et Académie de Finlande (M.P). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo et Jenna Ilomäki sont reconnus pour leur assistance technique. Les auteurs reconnaissent le laboratoire de poisson-zèbre de Tampere pour leur service.
Materials
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| Middlebrock OADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
| Middlebrock ADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| GENESYS20 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| 27G needle | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
| 1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Omnican 100 30G insulin needle | Braun | 9151133 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 1.5 ml homogenization tube | Qiagen | 13119-1000 | |
| 2.8 mm ceramic beads | Qiagen | 13114-325 | |
| Ethanol, ETAX Aa | Altia | ||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Chloroform | VWR | 22711.290 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118.2 g/mol |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 1613859 | FW 294.1 g/mol |
| Tris (free base) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121.14 g/mol |
| TRI reagent | Molecular Research Center | TR118 | Guanidine thiocyanate-phenol solution |
| PowerLyzer24 homogenizator | Qiagen | ||
| Sonicator m08 | Finnsonic | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
| qPCR 96-well plate | BioRad | HSP9601 | |
| Optically transparent film | BioRad | MSB1001 | |
| C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system | BioRad | ||
| RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 10666421 | decontamination reagent eliminating RNases |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Fluidigm | 100-6298 | |
| SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |
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