Modellierung von Tuberkulose Mycobacterium Marinum infizierten Erwachsenen Zebrafisch
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Modell menschlichen Tuberkulose in einem Erwachsenen Zebrafisch mit seiner natürlichen Erreger Mycobacterium Marinum. Extrahierte DNA und RNA aus den inneren Organen der infizierten Zebrafisch lässt sich zeigen, dass die Summe mykobakteriellen in die Fische und Immunantwort des Wirtes mit qPCR lädt.
Abstract
Mycobacterium Tuberculosis ist derzeit die tödlichsten menschlicher Erreger 1,7 Millionen Tote und 10,4 Millionen Infektionen jährlich. Belastung durch dieses Bakterium verursacht eine große Krankheit Spektrum beim Menschen von einer sterilisierten Infektion bis hin zu einer aktiv fortschreitenden tödlichen Krankheit. Die häufigste Form ist die latente Tuberkulose, die asymptomatisch, aber hat das Potential, in eine fulminante Krankheit zu reaktivieren. Erwachsenen Zebrafisch und seine natürliche Erreger Mycobacterium Marinum vor kurzem erwiesen sich ein anwendbaren Modell, das große Krankheit Spektrum der Tuberkulose zu studieren. Wichtig ist, können spontane Latenz sowie Reaktivierung und adaptive Immunantworten im Rahmen der mykobakteriellen Infektion in diesem Modell untersucht werden. In diesem Artikel beschreiben wir Methoden für die experimentelle Infektion von Erwachsenen Zebrafisch, der Sammlung der inneren Organe für die Extraktion von Nukleinsäuren für die Messung der mykobakteriellen Lasten und Host Immunantwort durch quantitative PCR. Die in-house entwickelten, M. Marinum –spezifische qPCR-Assay ist empfindlicher als die traditionellen Beschichtung-Methoden, da es auch DNA aus nicht teilt, ruhend oder kürzlich verstorbener Mykobakterien erkennt. Wie DNA und RNA aus der gleichen Person gewonnen werden, ist es möglich, die Beziehungen zwischen den krankhaften Zustand, und der Wirt und Erreger Genexpression zu studieren. Die Erwachsenen Zebrafisch-Modell für Tuberkulose präsentiert sich somit als sehr zutreffend, nicht-Säugetier in Vivo System zu Wirt-Pathogen Interaktionen zu untersuchen.
Introduction
Zebrafisch (Danio Rerio) ist eine weit verbreitete Tiermodell in der biomedizinischen Forschung, und es ist eine akzeptierte Modell für gemeinsame vertebrate Biologie. Der Zebrabärbling adaptiert wurde zu vielen Bereichen der Forschung Modellierung menschliche Krankheiten und Störungen, Krebs1 und Herzerkrankungen2 bis hin zu Infektionen und immunologische Studien aus mehreren bakteriellen 3 und Virusinfektionen4 , 5. Darüber hinaus die Entwicklung ex Utero Zebrafisch-Embryonen erzielt der Zebrabärbling ein beliebtes Modell in Entwicklungsbiologie6 und Toxikologie7,8.
In vielen Bereichen der Forschung, einschließlich der Infektionsbiologie sind die optisch transparenten zebrafischlarven gebräuchlich. Die ersten Immunzellen erscheinen innerhalb von 24 h Post Düngung (hpf), wenn primitive Makrophagen erkannten9sind. Neutrophile sind die nächsten Immunzellen rund 33 hpf10angezeigt werden. Zebrafisch-Larven sind somit für die Untersuchung der frühen Stadien der Infektion und die Rolle der angeborenen Immunität bei fehlender adaptive Immunzellen11möglich. Die Erwachsenen Zebrafisch mit seinem voll funktionsfähige adaptive Immunsystem bietet jedoch eine zusätzliche Schicht der Komplexität für Infektions-Experimente. T-Zellen können um durch erkannt werden 3 Tage nach Befruchtung12und B-Zellen sind in der Lage, funktionale Antikörper produzieren 4 Wochen Post Befruchtung13. Die Erwachsenen Zebrafisch hat die wichtigsten Gegenstücke des Säugetier-angeborenen und der adaptiven Immunsystems. Die wichtigsten Unterschiede zwischen den Immune systems von Fischen und Menschen werden in Antikörper-Klassen ebenso wie in der Anatomie des lymphatischen Geweben gefunden. Der Zebrabärbling hat nur drei Antikörper Klassen14, während Menschen fünf15haben. In Ermangelung von Knochenmark und Lymphknoten der primären lymphatischen Organe in den Fischen sind die Niere und die Thymus-16 und die Milz, die Nieren und den Darm als sekundären lymphatischen Organe17dienen. Trotz dieser Unterschiede, mit seiner vollen immun Arsenal der angeborenen und der adaptiven Zellen ist der Erwachsenen Zebrabärbling ein hoch anwendbar, einfach zu bedienende, nicht Mammalian Modell für Wirt-Pathogen-Wechselwirkungsstudien.
Der Zebrabärbling hat in letzter Zeit als eine praktikable Modell zur Tuberkulose18,19,20,21,22etabliert. Tuberkulose ist eine in der Luft Krankheit verursacht durch Mycobacterium Tuberculosis. Nach der World Health Organization Tuberkulose1,7 Millionen Todesopfer im Jahr 2016 und ist die führende Ursache des Todes von einem einzigen Erreger weltweit23. Mäuse24,25, Kaninchen26 und nicht-menschlichen Primaten27 sind die bekanntesten in der Tuberkuloseforschung aber jedes Gesicht ihre Grenzen Tiermodelle. Die nichtmenschlichen Primaten-Modell von M. Tuberkulose -Infektion ähnelt am ehesten der menschlichen Krankheit, aber mit Hilfe dieses Modells wird durch ernsthafte ethische Überlegungen. Anderen Tiermodellen sind durch die Wirtsspezifität von M. Tuberculosis behindert, die die Pathologie der Krankheit betrifft. Wahrscheinlich das größte Problem bei der Modellierung von Tuberkulose ist das breite Spektrum von Infektion und Krankheit folgen bei der menschlichen Krankheit: Tuberkulose ist eine sehr heterogene Erkrankung Immunität gegen latente, aktive und reaktivierten Infektion28 Sterilisation bis hin , das ist schwer zu reproduzieren und experimentell zu modellieren.
Mycobacterium Marinum ist ein enger Verwandter des M. Tuberculosis mit ~ 3.000 ortholog Proteine mit 85 % Aminosäure Identität29. M. Marinum infiziert natürlich Zebrafisch produziert Granulome, die Markenzeichen der Tuberkulose, in seiner inneren Organe19,30. Im Gegensatz zu anderen Tiermodellen in der Tuberkuloseforschung Zebrafisch produziert viele Nachkommen, es erfordert nur einen begrenzten Raum und wichtiger ist, es ist neurophysiologisch wenigsten entwickelten Wirbeltiere Tuberkulose-Modell zur Verfügung. Darüber hinaus verursacht die M. Marinum Infektion latente Infektion, aktiver Erkrankung oder auch Sterilisation von mykobakteriellen Infektion im Erwachsenen Zebrafisch eng imitiert das Spektrum der Krankheitsverläufe der menschlichen Tuberkulose19, 31 , 32. hier, wir beschreiben Methoden für das experimentelle Tuberkulose-Modell der Erwachsenen Zebrafisch durch M. Marinum in die Bauchhöhle injiziert und mittels quantitativen PCR zur Messung der mykobakteriellen Lasten und Immunreaktionen vom Zebrafisch Gewebeproben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir eine qPCR-basierte Anwendung mykobakteriellen Lasten aus DNA extrahiert von experimentell infizierten Erwachsenen Zebrafisch Gewebe messen. Diese Anwendung basiert auf Primer entwickelt, um die 16-23 s rRNA internen übertragenen Distanzscheibe Sequenz40. Mykobakteriellen Gesamtlast in einer Fisch-Probe wird geschätzt mit Hilfe einer Standardkurve aus DNA extrahiert aus einer bekannten Anzahl von kultivierten Mykobakterien und vorausgesetzt, dass ein Bakterium hat eine Kopie …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die finnische kulturelle Stiftung (H.L.), Tampere Tuberculosis Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., M.P.), Gründung des finnischen Anti-Tuberkulose-Vereins (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H., M.P.), Sigrid Jusélius Stiftung (M.P.), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H.), Jane und Aatos Erkko Stiftung (M.P.) und Academy of Finland (M.P.). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo und Jenna Ilomäki sind für ihre technische Unterstützung anerkannt. Die Autoren erkennen die Tampere Zebrafisch-Labor für ihren Dienst.
Materials
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| Middlebrock OADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
| Middlebrock ADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| GENESYS20 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| 27G needle | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
| 1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Omnican 100 30G insulin needle | Braun | 9151133 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 1.5 ml homogenization tube | Qiagen | 13119-1000 | |
| 2.8 mm ceramic beads | Qiagen | 13114-325 | |
| Ethanol, ETAX Aa | Altia | ||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Chloroform | VWR | 22711.290 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118.2 g/mol |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 1613859 | FW 294.1 g/mol |
| Tris (free base) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121.14 g/mol |
| TRI reagent | Molecular Research Center | TR118 | Guanidine thiocyanate-phenol solution |
| PowerLyzer24 homogenizator | Qiagen | ||
| Sonicator m08 | Finnsonic | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
| qPCR 96-well plate | BioRad | HSP9601 | |
| Optically transparent film | BioRad | MSB1001 | |
| C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system | BioRad | ||
| RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 10666421 | decontamination reagent eliminating RNases |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Fluidigm | 100-6298 | |
| SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |
Referencias
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80 (2015).
- Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research. Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).
- Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. Studying the immune response to human viral infections using zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).
- Thisse, C., Zon, L. I. Organogenesis–heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science. 295 (5554), 457-462 (2002).
- Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).
- Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
- Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model. Frontiers in Immunology. 8, 1703 (2017).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
- Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates. Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).
- Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).
- Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A. Ontogeny of the immune system of fish. Fish & shellfish. 20 (2), 126-136 (2006).
- Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish. PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).
- Tobin, D. M., et al. Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections. Cell. 148 (3), 434-446 (2012).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Berg, R. D., Ramakrishnan, L. Insights into tuberculosis from the zebrafish model. Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).
- Ordonez, A. A., et al. Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).
- Kramnik, I., Beamer, G. Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies. Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).
- Manabe, Y. C., et al. The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome. Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).
- Pena, J. C., Ho, W. Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned. Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).
- Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 691-702 (2017).
- Stinear, T. P., et al. Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).
- Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity. Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).
- Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
- Luukinen, H., et al. Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
- Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).
- Madigan, M., Martinko, J. . Brock Biology of Microorganisms. , (2016).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish:a practical approach. , (2002).
- Vanhauwaert, S., et al. Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies. Plos One. 9 (10), e109091 (2014).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
- Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).
- Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S. Macrophage immunoregulatory pathways in tuberculosis. Seminars in immunology. 26 (6), 471-485 (2014).
- Vynnycky, E., Fine, P. The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection. Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).
- Cobat, A., et al. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).
- Delogu, G., Goletti, D. The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics. Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).
- Abel, L., et al. Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives. Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75 (2018).
- Guryev, V., et al. Genetic variation in the zebrafish. Genome research. 16 (4), 491-497 (2006).
- Brown, K. H., et al. Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).
