在 vivosilk/aav 薄膜在光基因表达中的靶向表达
Summary
在这里, 我们提出了一种方法, 提供病毒表达载体到大脑使用丝素薄膜。这种方法允许使用 silk/aav 涂层光纤、锥形光纤和颅窗定向表达向量的传递。
Abstract
最近开发的用于操纵和监测神经元体内活动的光学方法极大地帮助了人们了解神经回路如何处理信息以驱动行为输出. 这些类型的实验依赖于两个主要组成部分: 1) 提供对大脑的光学访问的植入设备, 以及 2) 改变神经元兴奋性或提供神经元活动读数的感光蛋白。表达感光蛋白的方法有很多种, 但立体定向注入病毒载体是目前最灵活的方法, 因为表达可以通过遗传、解剖和时间精度来控制。尽管病毒载体的效用很大, 但将病毒传递到光学植入物的位置带来了许多挑战。立体定向病毒注射要求手术增加手术时间, 增加学习费用, 并对动物的健康构成威胁。注射注射器和高滴度病毒突然释放引起的免疫原性炎症会对周围组织造成物理损伤。当针对大脑深处的小区域时, 将注射与光学植入物对齐是特别困难的。为了克服这些挑战, 我们描述了一种用丝素和腺苷相关病毒 (aav) 载体组成的薄膜涂层多种类型光学植入物的方法。纤维蛋白是一种从蚕豆茧中提取的聚合物, 可以封装和保护生物分子, 并可加工成从可溶性薄膜到陶瓷的各种形式。当植入大脑时, silk/aav 涂层会在光学元件与周围大脑之间的界面释放病毒, 准确地将表达推向需要的地方。该方法易于实现, 有望极大地促进神经电路功能的体内研究。
Introduction
在过去的十年中产生了用于监测和操作神经活动的工程光敏蛋白的爆炸。病毒为在大脑中表达这些光遗传工具提供了无与伦比的灵活性。与转基因动物相比, 病毒更容易产生、运输和储存, 从而可以快速实施最新的光遗传学工具。表达可以遗传上针对不同的神经元群, 而为逆行运输而设计的病毒甚至可以用于基于神经元连接2的表达目标.
病毒通常是通过立体定向注射引入的, 这可能既耗时又具有挑战性。精确定位小区域可能会很困难, 而在广阔的区域内推动表达通常需要多次注射。此外, 当一个光学设备随后植入大脑, 在体内提供光, 植入物必须与病毒注射适当对齐。在这里, 我们描述了一种易于实现的方法, 用于使用丝素薄膜3将病毒载体传递给植入设备周围的组织。丝素是市售的, 神经组织耐受性良好, 可用于生产具有不同性能的材料。丝膜可应用于植入物, 使用常见的实验室设备, 如微注射移液器或手移液器。silk/aav 薄膜消除了对两个外科手术的要求, 并确保病毒介导的表达与光学植入物正确对齐。由此产生的表达被限制在纤维的尖端, 并导致较少不需要的表达沿纤维轨道比立体定向注射。
除了在小纤维尖端产生有针对性的表达外, silk/aav 薄膜还可用于驱动颅窗下广泛的 (和 gt;3 毫米直径) 皮质表达。荧光活性传感器的体内 2-光子成像已成为评价神经元活动在驱动感官和认知处理中的作用的不可或缺的工具。然而, 为了推动在广泛的皮质区域的均匀表达, 实验者经常进行多次注射。这些注射可能非常耗时, 并可能导致整个视野中的表达不一致。相比之下, 硅/aav 涂层的颅窗极易制造, 大大减少了手术所需的时间, 最引人注目的是推动在皮质表面以下的数百微米的表达。
Protocol
Representative Results
Discussion
使用 silk/aav 来定位光原蛋白的表达, 克服了目前正在使用的方法的局限性。尽管许多研究成功地使用 aav 注射来表达光基因蛋白, 但将表达与光纤尖端、锥形纤维长度周围的区域以及 grin 透镜的观察区域对齐是很有挑战性的。由于光学元件和光遗传表达之间的错位, 立体定向注入可能不可靠, 许多实验失败。我们这里描述的 silk/aav 标签方法解决了这个问题。它还简化了手术程序, 消除了第二个手术?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者希望感谢 j. vazquez 的插图, d. kaplan 和 c. preda 的试剂和有益的指导, 以及 b. sabatini 和 c. harvey 的实验室的体内成像。显微镜是由奥卡纳先生和神经生物学成像中心促成的, 部分支持神经成像中心是国家神经疾病和中风研究所 (nind) p30 核心中心赠款 (ns07203030) 的一部分。这项工作得到了 gvr khodadad 家庭基金会的支持, nancy lurie marks 基金会, 并由 nih 赠款, ninsr r21ns093498, u01ns108177 和 ninsds r35ns097284 至 w. g. r, 并由国家卫生研究院博士后研究金 f32ns101889 至 c. h. c。
Materials
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
| Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
| Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
| Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
| Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
| GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
| Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
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