In Vivo Mirati espressione delle proteine di optogenetica utilizzando seta/AAV film
Summary
Qui, presentiamo un metodo per la distribuzione di vettori di espressione virale nel cervello utilizzando seta fibroin film. Questo metodo consente la somministrazione mirata di vettori di espressione utilizzando fibre ottiche rivestite di seta/AAV, fibre ottiche coniche e windows cranica.
Abstract
La ricerca per comprendere i circuiti neurali come informazioni di processo in ordine per pilotare l’uscita comportamentale sono stata notevolmente facilitate da recentemente sviluppato metodi ottici per manipolare e monitoraggio dell’attività dei neuroni in vivo. Questi tipi di esperimenti si basano su due componenti principali: 1) impiantabili che forniscono accesso ottico al cervello e proteine 2) sensibili alla luce che cambiare l’eccitabilità neuronale o forniscono una lettura dell’attività neuronale. Ci sono un certo numero di modi per esprimere proteine sensibili alla luce, ma iniezione stereotassica di vettori virali attualmente è l’approccio più flessibile perché espressione può essere controllato con precisione genetica, anatomica e temporale. Nonostante la grande utilità di vettori virali, consegnando il virus al sito di ottica impianti pone numerose sfide. Iniezioni di virus stereotassiche chiedono interventi che aumentano il tempo chirurgico, aumentano il costo degli studi e costituiscono un rischio per la salute dell’animale. Il tessuto circostante può essere fisicamente danneggiato dalla siringa di iniezione e da immunogeno infiammazione causata dalla brusca somministrare un bolo di alto-titolo virus. Allineando le iniezioni con gli impianti ottici è particolarmente difficile quando la destinazione è piccole regioni profondità nel cervello. Per superare queste sfide, descriviamo un metodo per il rivestimento di più tipi di protesi ottiche con film composto di seta fibroin e Adeno-associato di vettori virali (AAV). Fibroina, un polimero derivato dal bozzolo del Bombyx mori, possibile incapsulare e proteggere biomolecole e possono essere trasformati in forme che vanno dalle pellicole solubile alla ceramica. Quando sono impiantati nel cervello, seta/AAV rivestimenti rilasciare virus all’interfaccia tra elementi ottici e cervello circostante, guida espressione proprio dove serve. Questo metodo viene implementato facilmente e promette di facilitare notevolmente gli studi in vivo della funzione del circuito neurale.
Introduction
Nell’ultimo decennio ha prodotto un’esplosione di proteine ingegnerizzate sensibili alla luce per il monitoraggio e manipolare l’attività neurale1. Virus offrono una flessibilità senza paragoni per esprimere questi strumenti optogenetica nel cervello. Confrontato agli animali transgenici, virus sono molto più facili da produrre, trasportare e conservare, garantendo una rapida implementazione dei più recenti strumenti optogenetica. Espressione può essere mirata geneticamente distinte popolazioni neuronali, e virus progettato per il trasporto retrogrado può essere utilizzato anche per espressione basata su connettività neuronale2di destinazione.
Virus di solito vengono introdotti con iniezioni stereotassiche, che possono essere lungo e impegnativo. Targeting con precisione piccole regioni può essere difficile, mentre guidando espressione sopra vasti settori spesso richiede molte iniezioni. Inoltre, quando un dispositivo ottico viene successivamente impiantato nel cervello per fornire luce in vivo, l’impianto deve essere correttamente allineato con l’iniezione virale. Qui, descriviamo un metodo facilmente implementati per la distribuzione di vettori virali per il tessuto intorno un dispositivo impiantato utilizzando seta fibroin film3. Seta fibroin è commercialmente disponibile, ben tollerato dai tessuti neurali e può essere usato per produrre materiali con proprietà diverse. Seta film può essere applicato agli impianti utilizzando attrezzature di laboratorio comuni come microiniezione pipette o pipette a mano. Seta/AAV film eliminare il requisito per due interventi chirurgici e garantire che espressione virus-mediate è correttamente allineato all’impianto ottico. L’espressione risultante è vincolato all’estremità delle fibre e risultati in meno espressione indesiderate lungo la pista di fibra rispetto iniezioni stereotassiche.
Oltre a produrre espressione mirata all’estremità di piccole fibre, seta/AAV film può essere utilizzato per guidare diffusa (> 3 mm di diametro) espressione corticale sotto windows cranica. In vivo imaging 2 fotoni di sensori di movimento fluorescente è diventato uno strumento indispensabile per valutare il ruolo dell’attività neuronale nel guidare l’elaborazione sensoriale e cognitivo. Tuttavia, per guidare uniforme espressione sopra le vaste aree corticali, sperimentatori spesso eseguire iniezioni multiple. Queste iniezioni possono essere estremamente che richiede tempo e possono portare all’espressione incoerente in tutto il campo visivo. Al contrario, seta/AAV-rivestito cranica windows sono estremamente facili da produrre, ridurre notevolmente il tempo richiesto per interventi chirurgici e guidare il più notevolmente espressione centinaia di micron sotto la superficie corticale.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’uso di seta/AAV per indirizzare l’espressione delle proteine optogentic supera i limiti degli approcci che sono attualmente in uso. Anche se molti studi correttamente utilizzano iniezioni di AAV per esprimere proteine optogenetica, è difficile da allineare espressione fino alla punta delle fibre ottiche, alle regioni intorno alla lunghezza delle fibre conici e nella regione di visualizzazione di una lente GRIN. A causa di disallineamento tra componenti ottici ed espressione optogenetica, iniezioni stereotassiche posso…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare J. Vazquez per illustrazioni, d. Kaplan e C. Preda per reagenti e indicazioni utili e i laboratori del B. Sabatini e C. Harvey per l’imaging in vivo . La microscopia è stato reso possibile da M. Ocana e il centro di formazione immagine di neurobiologia, sostenuta in parte dal centro di Imaging neurale come parte di un Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo (NINDS) P30 Core Center concedere (NS072030). Questo lavoro è stato sostenuto il GVR Khodadad Family Foundation, la Fondazione di Nancy Lurie Marks e dalle sovvenzioni NIH, NINDS R21NS093498, U01NS108177 e R35NS097284 di NINDS a W.G.R e da un postdoctoral fellowship di NIH F32NS101889 a C.H.C.
Materials
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
| Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
| Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
| Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
| Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
| GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
| Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
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