In Vivo Gerichte expressie van Optogenetic eiwitten met behulp van Silk/AAV Films
Summary
Hier presenteren we een methode voor het leveren van Virale expressievectoren in de hersenen met behulp van zijde fibroin films. Met deze methode kunt gerichte levering van expressievectoren met zijde/AAV gecoate optische vezels, taps toelopende optische vezels en craniale windows.
Abstract
De zoektocht om te begrijpen hoe neurale circuits Procesinformatie in volgorde naar station gedrags-uitvoer sterk door de onlangs ontwikkelde optische methoden geholpen heeft voor het manipuleren van en toezicht op de activiteit van neuronen in vivo. Dit soort experimenten is afhankelijk van twee hoofdcomponenten: 1) de implanteerbare hulpmiddelen die optische toegang bieden tot de hersenen, en 2) lichtgevoelige eiwitten die wijzigen van neuronale prikkelbaarheid of leveren een uitlezing van neuronale activiteit. Er zijn een aantal manieren uitspreken lichtgevoelige eiwitten, maar stereotaxic injectie van virale vectoren is momenteel de meest flexibele benadering omdat expressie kan worden gecontroleerd met genetische, anatomische en temporele precisie. Ondanks het grote nut van virale vectoren, het leveren van het virus naar de site van optische implantaten poses tal van uitdagingen. Stereotaxic virus injecties eisen chirurgie, die chirurgische tijd verhogen, verhogen de kosten van studies, en een risico voor de gezondheid van het dier. Het omliggende weefsel kan fysiek worden beschadigd door de injectiespuit en immunogene ontsteking veroorzaakt door de abrupte levering van een bolus van hoge-titer virus. Uitlijnen van injecties met optische implantaten is vooral moeilijk wanneer de doelcomputer kleine regio’s diep in de hersenen. Om deze uitdagingen te overwinnen, beschrijven we een methode voor het aanbrengen van meerdere soorten optische implantaten met films samengesteld van zijde fibroin en Adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren. Fibroin, een polymeer dat is afgeleid van de cocon van Bombyx mori, kunt samenvatten en beschermen van biomoleculen en in vormen variërend van oplosbare films tot keramiek kan worden verwerkt. Wanneer de hersenen ingeplant, laat zijde/AAV coatings virus op het raakvlak tussen optische elementen en de omringende hersenen, rijden expressie precies waar dat nodig is. Deze methode is eenvoudig toe te passen en belooft te sterk vergemakkelijken in vivo onderzoeken van neurale functie.
Introduction
De afgelopen tien jaar heeft geproduceerd een explosie van gemanipuleerde lichtgevoelige eiwitten voor monitoring en manipuleren van neurale activiteit1. Virussen bieden ongeëvenaarde flexibiliteit voor het uitdrukken van deze hulpmiddelen van de optogenetic in de hersenen. Ten opzichte van transgene dieren, zijn virussen veel gemakkelijker te produceren, transporteren en opslaan, waardoor snelle implementatie van de nieuwste optogenetic hulpmiddelen. Expressie kan op verschillende neuronale populaties genetisch worden gericht, en virussen ontworpen voor de retrograde vervoer kunnen zelfs gebruikt worden om expressie gebaseerd op neuronal connectiviteit2.
Virussen komen meestal met stereotaxic injecties, die tijdrovend en uitdagend kunnen. Juist gericht op kleine regio’s kunnen moeilijk, terwijl veel injecties expressie rijden over grote gebieden vaak vereist. Bovendien, wanneer een optisch instrument vervolgens geïmplanteerde in de hersenen is te leveren licht in vivo, het implantaat moet correct wordt uitgelijnd met de virale injectie. Hier beschrijven we een gemakkelijk geïmplementeerde methode voor het leveren van virale vectoren aan het weefsel rond een geïmplanteerde apparaat met behulp van zijde fibroin films3. Zijde fibroin is commercieel beschikbaar, goed verdragen door zenuwweefsel, en kan worden gebruikt voor de productie van materialen met diverse eigenschappen. Zijde films kunnen worden toegepast op implantaten met behulp van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur zoals microinjection pipetten of hand pipetten. Zijde/AAV films de eis voor twee chirurgische procedures elimineren en ervoor zorgen dat virus-gemedieerde expressie correct wordt uitgelijnd met het optische implantaat. De resulterende expressie is beperkt tot het puntje van de vezels en resultaten in minder ongewenste expressie langs het spoor van de vezels dan stereotaxic injecties.
Naast het produceren van gerichte expressie op het puntje van kleine vezels, zijde/AAV films kunnen worden gebruikt om grootschalige rijden (> 3 mm doorsnede) corticale expressie onder craniale windows. In vivo 2-foton beeldvorming van fluorescerende activiteit sensoren is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument voor de beoordeling van de rol van neuronale activiteit in het rijden van zintuiglijke en cognitieve verwerking. Echter om uniforme uitdrukking over de brede corticale gebieden, onderzoekers vaak uitvoeren meerdere injecties. Deze injecties kunnen zeer tijdrovend en kunnen leiden tot inconsistente expressie het gezichtsveld. Daarentegen zijn zijde/AAV-gecoate craniale ramen zeer eenvoudig te fabriceren, sterk verminderen de tijd die nodig is voor operaties en meest opmerkelijk drive expressie honderden van micron onder de corticale oppervlak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gebruik van zijde/AAV te richten op de expressie van optogentic eiwitten overwint beperkingen van benaderingen die momenteel in gebruik. Hoewel vele studies succesvol AAV injecties gebruiken uitspreken optogenetic eiwitten, is het uitdagend expressie naar het uiteinde van de optische vezels, regio’s rond de lengte van taps toelopende vezels, en de regio bekijken van een grijns lens worden uitgelijnd. Vanwege de afwijking tussen optische componenten en optogenetic expressie, stereotaxic injecties kunnen onbetrouwbaar …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank J. Vazquez voor illustraties, D. Kaplan en C. Preda voor reagentia en behulpzame begeleiding, en de laboratoria van B. Sabatini en C. Harvey voor in vivo imaging. Microscopie werd mogelijk gemaakt door M. Ocana en de neurobiologie Imaging Center, gedeeltelijk ondersteund door de neurale Imaging Center als onderdeel van een National Institute of Neurological Disorders en Stroke (NINDS) P30 Core Center verlenen (NS072030). Dit werk werd gesteund door de GVR Khodadad Family foundation, de Nancy Lurie merken foundation, en NIH grants, NINDS R21NS093498, U01NS108177 en NINDS R35NS097284 te W.G.R, en door een NIH postdoctoral fellowship F32NS101889 te C.H.C.
Materials
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
| Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
| Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
| Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
| Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
| GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
| Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
Referencias
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Tervo, D. G., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Jackman, S. L., et al. Silk Fibroin Films Facilitate Single-Step Targeted Expression of Optogenetic Proteins. Cell Reports. 22 (12), 3351-3361 (2018).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (68), e50004 (2012).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2011).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (3), 194 (2007).
- Cao, Y., Wang, B. Biodegradation of silk biomaterials. International Journal of Molecular Sciences. 10 (4), 1514-1524 (2009).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nature Neuroscience. 13 (5), 584-591 (2010).
- Hines, D. J., Kaplan, D. L. Mechanisms of controlled release from silk fibroin films. Biomacromolecules. 12 (3), 804-812 (2011).
- Hu, X., et al. Regulation of silk material structure by temperature-controlled water vapor annealing. Biomacromolecules. 12 (5), 1686-1696 (2011).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Yucel, T., Cebe, P., Kaplan, D. L. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels. Biophysical Journal. 97 (7), 2044-2050 (2009).
- Wang, X., Kluge, J. A., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. Sonication-induced gelation of silk fibroin for cell encapsulation. Biomaterials. 29 (8), 1054-1064 (2008).
- Lee, J., Park, S. H., Seo, I. H., Lee, K. J., Ryu, W. Rapid and repeatable fabrication of high A/R silk fibroin microneedles using thermally-drawn micromolds. European Journal of Biopharmaceutics. 94, 11-19 (2015).
