Vivo Optogenetic proteinlerin ipek/AAV filmleri kullanarak hedeflenen ifade
Summary
Burada, viral ifade vektörel çizimler ipek fibroin Filmler kullanarak beynine teslim etmek için bir yöntem mevcut. Bu yöntem ifade vektörel çizimler ipek/AAV kaplamalı optik lifler, konik optik lifler ve kafatası windows kullanarak hedeflenen teslimini sağlar.
Abstract
Ne kadar sinir devreleri işlem bilgileri sürücü davranış çıkış amacıyla büyük ölçüde işleme ve nöronlar içinde vivoetkinliğini izleme için son zamanlarda geliştirilen optik yöntemlerle destekli anlamak için arayışı. Bu tür deneyler iki ana bileşenleri üzerinde bağlıdır: beynin optik erişim sağlamak 1) implante edilebilir cihazların ve nöronal uyarılabilirlik değiştirmek veya bir okuma nöronal aktivitenin sağlayabilirsiniz 2) ışığa duyarlı proteinlerdir. Işığa duyarlı proteinler hızlı yolları vardır, ancak ifade, anatomik, genetik ve zamansal hassasiyetle kontrol edilebilir çünkü viral vektörler stereotaksik enjeksiyon şu anda en esnek yaklaşım. Viral vektörler büyük yarar rağmen virüs sayısız sorunlar optik implantlar pozlar siteye teslim. Stereotaksik virüs enjeksiyonları cerrahi süresini artırmak, çalışmaları maliyetini artırmak ve hayvan sağlığı için riski ameliyatları talep ediyorlar. Çevreleyen doku fiziksel olarak enjeksiyon şırınga ve immünojenik iltihap yüksek titresi virüs bolus ani teslim tarafından neden olduğu zarar görebilir. Enjeksiyonları optik implantlar ile hizalama zor özellikle küçük bölgeleri hedeflerken beynin derinliklerinde. Bu zorlukları aşmak için birden çok türü Filmler Adeno ilişkili viral (AAV) vektörel çizimler ve ipek fibroin oluşan optik implantlarda kaplama yöntemi açıklanmaktadır. Fibroin, Bombiks mori, koza türetilmiş bir polimer Kapsüller ve biomolecules korumak ve çözünür filmlerden seramik için değişen formları içine işlenebilir. Beyne ipek/AAV kaplamalar tam olarak gerektiğinde ifade sürüş arabirimi optik elemanları ve çevresindeki beyin arasında virüs serbest. Bu yöntem kolayca uygulanır ve in vivo çalışmalar nöral devre fonksiyonunun büyük kolaylaştırmak vaat ediyor.
Introduction
Son on yıl için izleme ve sinirsel aktivite1manipüle mühendislik ışığa duyarlı proteinlerin bir patlama üretti. Virüsler bu optogenetic araçlar beyinde ifade etmek için benzersiz esneklik sunar. Transjenik hayvanlar için karşılaştırıldığında, virüs üretmek, ulaşım ve mağaza, en yeni optogenetic araçların hızlı uygulama izin için daha kolay. İfade için farklı nöron popülasyonları genetik olarak yönlendirilebilir ve retrograd taşıma için tasarlanmış virüs bile nöronal bağlantı2dayalı ifade hedeflemek için kullanılır.
Virüsler genellikle zaman alıcı ve zor olabilir stereotaksik enjeksiyonları ile tanıtılmaktadır. Tam olarak küçük bölgeleri hedefleme-ebilmek var olmak zor, ifade kez geniş alanlar üzerinde sürüş birçok enjeksiyonları gerekirken. Bir optik cihaz daha sonra hafif vivo içindeteslim etmek için beynine yerleştirilmiş iken, Ayrıca, İmplantın doğru viral enjeksiyon ile hizalı gerekir. Burada, kolayca uygulanabilir bir yöntem viral vektörler ipek fibroin Filmler3kullanarak bir implant cihaz etrafında doku teslim etmek için açıklamak. İpek fibroin piyasada bulunan, nöral dokular tarafından iyi tolere ve çeşitli özellikleri ile malzeme üretmek için kullanılabilir. İpek filmleri ya da mikroenjeksiyon Pipetler gibi ortak labaratuar donanımları kullanarak implantlar için uygulanan Pipetler el. İpek/AAV filmleri iki cerrahi işlemler gereksinimini ortadan kaldırmak ve virüs-aracılı ifade düzgün optik implant uyumlu olun. Sonuçta elde edilen ifade lifleri ve lif parça daha az istenmeyen ifadeye stereotaksik enjeksiyonları daha sonuçlarında ucuna sınırlıdır.
Hedeflenen ifade ucundaki küçük liflerinin üreten ek olarak, ipek/AAV filmleri yaygın sürücü için kullanılabilir (> 3 mm çapında) kafatası windows altında kortikal ifade. İn vivo 2-Foton görüntüleme floresan etkinlik sensörler duyusal ve bilişsel işleme sürüş nöronal aktivite rolünün değerlendirilmesi için vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir. Ancak, ifade geniş kortikal alanlarda Denemecileri kez üzerinde üniforma sürücü için birden fazla enjeksiyonları gerçekleştirin. Bu iğneleri son derece zaman alıcı olabilir ve tutarsız ifade görüş alanı açabilir. Buna ek olarak, kafatası windows ipek/AAV-ceket imalatı, büyük ölçüde ameliyatları için gereken süreyi azaltmak ve en dikkat çekici ifade yüz mikron kortikal yüzeyinin altında sürücü son derece kolaydır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ifade optogentic proteinlerin hedeflemek için ipek/AAV kullanımı geçerli olarak kullanımda olan yaklaşımlar sınırlamalar üstesinden gelir. Birçok çalışmalar başarıyla AAV enjeksiyonları optogenetic proteinler ifade etmek için kullansa da, ifade optik lifler ucu, bölgeler konik elyaf uzunluğu çevresinde ve bir SIRITIŞ lens görüş bölgenin hizalamak için meydan okuyor. Kayma optik bileşenleri ve optogenetic ifade arasında nedeniyle stereotaksik enjeksiyonları güvenilmez olabilir ve birçok den…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar J. Vazquez resimler için D. Kaplan ve C. Preda’nın reaktifler ve yararlı rehberlik ve B. Sabatini ve C. Harvey labs vivo içinde görüntüleme için teşekkür etmek istiyorum. Mikroskopi M. Ocana ve kısmen bir bölümü, bir Ulusal Enstitüsü, nörolojik bozukluklar olarak nöral görüntüleme Merkezi tarafından desteklenen Nörobiyoloji görüntüleme Merkezi tarafından mümkün yapıldı ve kontur (NINDS) P30 çekirdek Merkezi (NS072030) verin. Bu eser ve NIH hibe, NINDS R21NS093498, U01NS108177 ve NINDS R35NS097284 için W.G.R ve C.H.C. için bir NIH doktora sonrası bursu F32NS101889 GVR Khodadad Aile Vakfı, Nancy Lurie işaretleri Vakfı tarafından desteklenmiştir
Materials
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
| Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
| Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
| Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
| Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
| GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
| Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
Referencias
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Tervo, D. G., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Jackman, S. L., et al. Silk Fibroin Films Facilitate Single-Step Targeted Expression of Optogenetic Proteins. Cell Reports. 22 (12), 3351-3361 (2018).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (68), e50004 (2012).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2011).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (3), 194 (2007).
- Cao, Y., Wang, B. Biodegradation of silk biomaterials. International Journal of Molecular Sciences. 10 (4), 1514-1524 (2009).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nature Neuroscience. 13 (5), 584-591 (2010).
- Hines, D. J., Kaplan, D. L. Mechanisms of controlled release from silk fibroin films. Biomacromolecules. 12 (3), 804-812 (2011).
- Hu, X., et al. Regulation of silk material structure by temperature-controlled water vapor annealing. Biomacromolecules. 12 (5), 1686-1696 (2011).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Yucel, T., Cebe, P., Kaplan, D. L. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels. Biophysical Journal. 97 (7), 2044-2050 (2009).
- Wang, X., Kluge, J. A., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. Sonication-induced gelation of silk fibroin for cell encapsulation. Biomaterials. 29 (8), 1054-1064 (2008).
- Lee, J., Park, S. H., Seo, I. H., Lee, K. J., Ryu, W. Rapid and repeatable fabrication of high A/R silk fibroin microneedles using thermally-drawn micromolds. European Journal of Biopharmaceutics. 94, 11-19 (2015).
