Vivo에서 실크/AAV 영화를 사용 하 여 Optogenetic 단백질의 표적으로 표현
Summary
여기, 우리는 바이러스 성 식 벡터 실크 fibroin 영화를 사용 하 여 뇌에 전달 하는 방법을 제시. 이 메서드는 식 벡터 실크/AAV 코팅된 광섬유, 광섬유 테이퍼 및 두개골 창 사용의 대상된 배달 수 있습니다.
Abstract
드라이브 동작 출력 하기 위해서는 프로세스 정보를 크게 조작 하 고 신경 비보의 활동을 모니터링에 대 한 최근 개발 된 광학 방법으로 지원 되었습니다 어떻게 신경 회로 이해 하는 탐구. 두 가지 주요 구성 요소에 의존 하는 이러한 유형의 실험: 두뇌에 광 액세스를 제공 하는 1) 이식 장치 및 신경 흥분을 변경 또는 신경 활동의 판독을 제공 하는 2) 빛에 민감한 단백질. 빛에 민감한 단백질을 표현 하는 방법의 수 있지만 바이러스 성 벡터의 stereotaxic 주입은 현재 가장 유연한 접근 식 유전, 해부학, 그리고 시간적 정밀도로 제어할 수 있기 때문에. 바이러스 성 벡터의 위대한 유틸리티에 불구 하 고 제공 하는 바이러스 광학 임 플 란 트 포즈의 사이트에 수많은 도전을. Stereotaxic 바이러스 주사는 수술 수술 시간을 증가, 연구, 비용 증가 및 동물의 건강에 위험이 포즈를 요구 하 고 있다. 주입 주사기와 높은 titer 바이러스의 bolus의 갑작스러운 납품으로 인 한 면역성 염증 주변 조직은 물리적으로 손상 될 수 있습니다. 작은 영역을 대상으로 주사 광학 임 플 란 트를 정렬 하는 것은 특히 어려운 뇌에 깊은. 이러한 과제를 극복 하기 위해 여러 유형의 영화 실크 fibroin 및 Adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터의 구성된으로 광학 임 플 란 트를 코팅 하는 방법을 설명 합니다. Fibroin, 누에나방, 누에고치에서 파생 된 폴리머 캡슐화 할 수 있습니다 및 생체를 보호 하 고 수용 성 필름에서 도자기까지 양식에 처리할 수 있습니다. 뇌에 이식, 실크/AAV 코팅 식이 필요한 곳에 정확 하 게 운전 하는 광학 요소와 주변 뇌 사이의 인터페이스에서 바이러스를 해제 합니다. 이 메서드는 쉽게 구현 되며 크게 신경 회로 기능 vivo에서 연구를 촉진 하는 약속.
Introduction
지난 10 년간 모니터링 및 신경 활동1조작에 대 한 설계 빛에 민감한 단백질의 폭발을 생산 하고있다. 바이러스는 뇌에서 이러한 optogenetic 도구를 표현 하기 위한 탁월한 유연성을 제공 합니다. 유전자 변형 동물에 비해, 바이러스까지 쉽게 생산, 수송, 저장, 최신 optogenetic 도구 빠른 구현을 허용 하는. 식 유전자 뚜렷한 신경 인구를 대상 수 있습니다 그리고 역행 수송을 위해 고안 된 바이러스도 대상으로 신경 연결2를 기반으로 식에 사용할 수 있습니다.
바이러스는 일반적으로 시간이 많이 걸리는 및 어려운 수 stereotaxic 주사와 함께 도입 됩니다. 정확 하 게 작은 영역을 대상으로 어려울 수 있습니다, 하지만 종종 넓은 지역에 식 운전 많은 주사. 또한, 광학 장치 이후에 빛 vivo에서제공 하는 두뇌에 심은 경우는 임 플 란 트 정렬 되어야 합니다 제대로 바이러스 주입으로. 여기, 이식된 장치 실크 fibroin 영화3를 사용 하 여 주위 조직에 바이러스 성 벡터를 제공 하기 위한 쉽게 구현 하는 방법을 설명 합니다. 실크 fibroin 상용, 신경 조직에 의해 잘 용납 이며 다양 한 특성을 가진 재료를 생산 하는데 사용 될 수 있습니다. 실크 영화 microinjection 펫 같은 일반적인 실험실 장비를 사용 하 여 임 플 란 트에 적용할 수 또는 펫 손. 실크/AAV 영화 두 수술 절차에 대 한 요구를 제거 하 고 바이러스 중재 식 광학 임 플 란 트에 제대로 정렬입니다. 결과 식이 섬유, 그리고 stereotaxic 주사 보다 섬유 트랙을 따라 덜 원치 않는 식에는 결과의 끝에 제한 됩니다.
대상된 표현의 끝에 작은 섬유 생산, 뿐만 아니라 실크/AAV 영화를 광범위 하 게 사용할 수 있습니다 (> 3 m m 직경) 두개골 창 아래 피 질 식. 형광 활동 센서의 2 광자 영상 vivo에서 감각 및 인지 처리 운전에 신경 활동의 역할을 평가 하기 위한 필수적인 도구 되고있다. 그러나, 동일한 드라이브에 광범위 한 대뇌 피 질의 영역, 자주 경험 식 여러 주사를 수행 합니다. 이러한 주사 매우 시간이 오래 걸릴 수 있으며 보기의 필드에 걸쳐 일치 하지 않는 식으로 이어질 수 있습니다. 반면, 실크/AAV 코팅 두개골 윈도우는 매우 쉽게 제조, 크게 수술에 필요한 시간을 줄일 수 및 가장 눈에 띄게 표현 수백 미크론 대뇌 피 질의 표면 아래 드라이브.
Protocol
Representative Results
Discussion
실크/optogentic 단백질의 표현 대상으로 AAV를 사용 하 여 현재 사용 중인 접근법의 한계를 극복 한다. 많은 연구에서는 성공적으로 AAV 주사를 사용 하 여 optogenetic 단백질을 표현 하기 위해, 비록 식 광 섬유의 끝에, 테이퍼 섬유의 길이 주변 지역 그리고 미소 렌즈의 보기 영역에 맞게 도전 이다. 광학 부품 및 optogenetic 식 사이의 부정합, 인해 stereotaxic 주사 신뢰할 수 있는, 수 고 많은 실험 실패. 실크…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 대 제이 바스 케 스, D. 카 플 란과 C. Preda 시 약 및 유용한 지도, 그리고 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 B. 사바 티 니 및 C. 하 비의 실험실에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 현미경 M. Ocana 지원 부분에서 신경 이미징 센터는 국립 연구소의 신경 장애의 신경 생물학 이미징 센터에 의해 가능 하 게 되었다 고 치기 (NINDS) P30 코어 센터 (NS072030)를 부여 합니다. GVR 호 가족 재단, 낸시 Lurie 마크 재단과 NIH 교부 금, NINDS R21NS093498, U01NS108177 및 W.G.R에 NINDS R35NS097284과 C.H.C.에는 NIH 박사 후 친목 F32NS101889이이 작업 지원
Materials
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
| Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
| Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
| Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
| Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
| GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
| Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
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