تطبيقات رسم الخرائط الزمانية وتقنيات تحليل الجسيمات للتحديد الكمي لداخل الخلية Ca2 + إشارات في الموقع

Summary

وراثيا المرمزة Ca^{2 +} المؤشرات (جيسيس) قد تغيرت تغيرا جذريا في الموقع كيف Ca^{2 +} تصوير تتم. إلى أقصى حد ممكن لاستعادة البيانات من هذه التسجيلات، مطلوب تحليل Ca^{2 +} إشارات مناسبة. البروتوكولات في هذه الورقة تيسير التحديد الكمي ل Ca^{2 +} إشارات سجلت في الموقع باستخدام رسم الخرائط الزمانية المكانية والتحليل القائم على الجسيمات.

Abstract

Ca^{2 +} تصوير الخلايا المعزولة أو أنواع محددة من الخلايا داخل أنسجة سليمة وكثيراً ما تكشف عن أنماط معقدة من Ca^{2 +} إشارات. ويتطلب هذا النشاط تحليلات متأنية ومتعمقة، والتقدير الكمي لالتقاط قدر ممكن من المعلومات حول الأحداث الأساسية. المكانية، الزمانية وكثافة معلمات المضمنة إلى Ca^{2 +} إشارات مثل تواتر ومدة، ونشر، والسرعة والسعة قد توفر بعض المعلومات البيولوجية اللازمة للإشارات داخل الخلايا. عالية الاستبانة Ca^{2 +} التصوير عادة النتائج في الحصول على ملفات البيانات الكبيرة التي تستغرق وقتاً طويلاً للعملية من حيث ترجمة المعلومات التصوير إلى بيانات قابلة للقياس الكمي، وهذه العملية يمكن أن تكون عرضه للخطأ البشري والتحيز. تحليل Ca^{2 +} الإشارات من الخلايا في الموقع يعتمد عادة على قياسات كثافة بسيطة من مناطق مختارة تعسفاً للفائدة (ROI) ضمن مجال رؤية (FOV). وهذا النهج يتجاهل الكثير من المعلومات الهامة إرسال الإشارات الواردة في فوف. وهكذا، من أجل تحقيق أقصى قدر من استرداد المعلومات من هذه التسجيلات عالية الدقة التي تم الحصول عليها مع Ca^{2 +}الأصباغ أو أوبتوجينيتيك Ca^{2 +} التحليل المكاني والزماني التصوير، والمناسبة من Ca^{2 +} الإشارات مطلوب. وسيصف البروتوكولات المبينة في هذه الورقة كيف يمكن الحصول على حجم كبير من البيانات من Ca^{2 +} تصوير تسجيلات لتيسير تحليل أكثر اكتمالا والتحديد الكمي ل Ca^{2 +} الإشارات المسجلة من الخلايا باستخدام مزيج من خريطة الزمانية المكانية (STM)-استناداً إلى التحليل والتحليل القائم على الجسيمات. كما وصف البروتوكولات كيف مختلف أنماط Ca^{2 +} الإشارات الملحوظة في خلية مختلفة يمكن تحليل السكان في الموقع المناسب. للتوضيح، الطريقة التي ستدرس Ca^{2 +} إشارات في عدد سكان متخصصة من الخلايا في الأمعاء الدقيقة، الخلايا فراغي من كيال (ICC)، استخدام جيسيس.

Introduction

Ca^{2 +} هو رسول داخل الخلايا في كل مكان التي تسيطر على مجموعة واسعة من العمليات الخلوية، مثل العضلات انكماش^1،2،³من الأيض، خلية انتشار^{3،4، 5}، والحث على إطلاق سراح العصبي في الأعصاب الطرفية^6،7، وتفعيل النسخ العوامل في النواة. ⁷ داخل الخلية Ca^{2 +} إشارات غالباً ما تتخذ شكل ارتفاعات عابرة في كاليفورنيا سيتوسوليك^{2 +}، وهذه يمكن أن تكون عفوية أو تنشأ من التحفيز مؤثر تبعاً لنوع الخلية⁸. المكانية، الزمانية وكثافة معلمات المضمنة إلى Ca^{2 +} إشارات مثل التردد والمدة، ونشر، والسرعة والسعة ويمكن توفير المعلومات البيولوجية المطلوبة ل التنبيه داخل الخلايا^{5، 7 , 9}-هيولى Ca^{2 +} إشارات يمكن أن تنجم عن تدفق Ca^{2 +} من الفضاء خارج الخلية أو عن طريق Ca^{2 +} الإصدار من هيولى (ER) عبر قنوات Ca^{2 +} الإصدار مثل مستقبلات ريانوديني (ريرس) ومستقبلات اينوزيتول-ثلاثي-الفوسفات (IP₃Rs)¹⁰. ريرس والملكية الفكرية₃روبية قد تسهم على حد سواء لتوليد إشارات Ca^{2 +} ويمكن أن يؤدي فتح هذه القنوات، الذي جنبا إلى جنب مع مختلف Ca^{2 +} تدفق آليات منسقة في عدد ضخم من Ca^{2 +} يشير إلى أنماط أن تتشكل بالأرقام وفتح احتمال Ca^{2 +} قنوات تدفق، التعبير الشخصية من Ca^{2 +} الإفراج عن القنوات، القرب بين Ca^{2 +} تدفق والإفراج عن القنوات، والتعبير والتوزيع من كاليفورنيا^{2 +} البروتينات امتصاص والنتوء. Ca^{2 +} إشارات قد تتخذ شكل موحد، طويلة الأمد، ذبذبات عالية الكثافة العالمية التي قد تستمر لعدة ثوان أو دقائق حتى، نشر داخل الخلايا وبين الخلايا Ca^{2 +} الأمواج التي قد تعبر المسافات داخل الخلايا ما يزيد على 100 ميكرومتر^10،11،،من^1213،14،،من¹⁵¹⁶، أو المزيد من الأحداث موجزة، ومكانيا مترجمة مثل Ca^{2 +} الشرر و Ca^{2 +} نفث التي تحدث على عشرات الجداول الزمنية ميلي ثانية واحدة، وانتشار أقل من 5 ميكرومتر^17،،^،من^1819،20.

مجهر فلوري قد استخدمت على نطاق واسع لرصد Ca^{2 +} الإشارات في الخلايا المعزولة ومثقف وفي أنسجة سليمة. وتقليدياً، هذه التجارب انطوت على استخدام الفلورية Ca^{2 +} المؤشرات، راتيوميتريك والأصباغ غير راتيوميتريك مثل Fura2 أو Fluo3/4 أو Rhod2، من بين آخرين ^21،،من²²²³. هذه المؤشرات قد صممت لتكون نفاذية أغشية الخلايا وثم أصبحوا محاصرين في الخلايا بالانقسام من جماعة إستر عبر esterases الذاتية. ملزمة من Ca^{2 +} لمؤشرات ترابط عالية تسبب التغييرات في الأسفار عندما كانت مضاءة الخلايا والأنسجة بالمناسبة الأطوال الموجية للضوء. استخدام الخلية نفاذية Ca^{2 +} مؤشرات تتعزز فهمنا من Ca^{2 +} إشارات في الخلايا الحية ويسمح القرار المكانية والتحديد الكمي لهذه الإشارات التي لم يكن من الممكن بالمعايرة Ca^{2 +} إشارات من خلال وسائل أخرى، مثل الكهربية. ومع ذلك، قد Ca^{2 +} المؤشرات التقليدية العديد من القيود، مثل فوتوبليتشينج التي تحدث على مدى فترات ممتدة من تسجيل²⁴. في حين أحدث Ca^{2 +} مؤشر الأصباغ مثل Cal520/590 قد تحسنت كثيرا إشارة إلى نسب الضوضاء والقدرة على اكتشاف المحلية Ca^{2 +} إشارات²⁵، قضايا مع فوتوبليتشينج يمكن لا تزال مصدر قلق لبعض المحققين ^2627،،28. فوتوبليتشينج متسرعة كما يقيد التكبير، المعدل للحصول على الصور، والقرار التي يمكن استخدامها للتسجيلات، كما تتطلب زيادة قوة موضوعية ومعدلات أعلى للحصول على الصور زادت كثافة الضوء الإثارة التي يزيد من فوتوبليتشينج.

هذه القيود التقليدية Ca^{2 +} مؤشر الأصباغ تتفاقم عند تسجيل Ca^{2 +} إشارات في الموقع، على سبيل المثال عند تسجيل داخل الخلية Ca^{2 +} إشارات من أنسجة سليمة. بسبب المشاكل المذكورة أعلاه، التصور Ca^{2 +} إشارات في الموقع باستخدام الخلية نفاذية Ca^{2 +} مؤشرات تم محدودة إلى تضخم منخفضة الطاقة وتخفيض المعدلات لالتقاط الصور، ويقيد قدرة المحققين لتسجيل و تحديد Ca^{2 +} إشارات سوبسيلولار المقيدة زمنياً أو مكانياً. وبالتالي، كان من الصعب التقاط وتحليلها، ونقدر تعقيد المكانية والزمانية Ca^{2 +} الإشارات، التي يمكن أن تكون هامة في توليد الاستجابات البيولوجية المطلوبة، كما هو مبين أعلاه. تحليل Ca^{2 +} الإشارات من الخلايا في الموقع يعتمد عادة على قياسات كثافة بسيطة من مناطق مختارة للفائدة (ROI) ضمن مجال رؤية (FOV). يمكن تحيز الاختيار التعسفي لعدد وحجم وموضع رويس، تعتمد على أهواء الباحث، شدة النتائج المتحصل عليها. كذلك التحيز المتأصل بتحليل العائد على الاستثمار، هذا النهج يتجاهل الكثير من أهمية مما يشير إلى المعلومات التي تتضمنها فوف، كدينامية Ca^{2 +} الأحداث داخل تعسفاً المختار يتم تحديد العائد على الاستثمار للتحليل. وعلاوة على ذلك، فشل تحليل رويس لتقديم معلومات عن الخصائص المكانية من Ca^{2 +} إشارات لاحظ. على سبيل المثال، قد لا يكون ممكناً للتمييز بين ارتفاع Ca^{2 +} الناتجة نشر Ca^{2 +} موجه وكاليفورنيا مترجمة عالية^{2 +} الإفراج عن الحدث من تبويبات Ca^{2 +} إشارات داخل العائد على الاستثمار.

ظهور المرمزة وراثيا Ca^{2 +} المؤشرات (جيسيس) قد تغيرت تغيرا جذريا في كيف يمكن أن يكون Ca^{2 +} تصوير المؤداة في الموقع^29،30،،من^3132،33 . وهناك العديد من المزايا لاستخدام جيسيس أكثر الأصباغ. وربما الأكثر أهمية هو أن التعبير عن جيتشي يمكن أن يؤديها بطريقة محددة في خلية، مما يقلل من تلوث الخلفية غير المرغوب فيها من الخلايا لا فائدة. ميزة أخرى جيسيس فوق Ca^{2 +} المؤشرات التقليدية أن فوتوبليتشينج انخفاض (كما الأسفار والتبعية فوتوبليتشينج فقط يحدث عندما الخلايا تكون نشطة)، بالمقارنة مع عينات محملة بصبغة، لا سيما في عالية التكبير، والمعدلات العالية للصورة التقاط³⁴. وهكذا، التصوير مع جيسيس، مثل سلسلة جكامب من أجهزة استشعار أوبتوجينيتيك، يتيح للمحققين القدرة على تسجيل موجز، المترجمة دون الخلوية Ca^{2 +} إشارات في الموقع والتحقيق Ca^{2 +} الإشارات في الخلايا داخل بهم بيئات الأصلي الذي لم يكن ممكناً سابقا. لتحقيق أقصى قدر من استرداد المعلومات من هذه التسجيلات عالية الاستبانة، التحليل المكاني والزماني المناسب من Ca^{2 +} الإشارات مطلوب. تجدر الإشارة إلى أنه بينما يمكن أن توفر جيسيس بعض مزايا واضحة، قد كشفت الدراسات الأخيرة أن Ca^{2 +} تصوير يمكن أن يتم بنجاح من إعداد كبيرة من السكان من مختلف الطبقات الكيميائية العصبية من الخلايا العصبية في وقت واحد باستخدام التقليدية Ca^{2 +} المؤشرات التي لا يتم ترميز وراثيا في الحيوان³⁵. هذا النهج المستخدمة immunohistochemistry المخصصة بعد الكشف عن عدة فئات مختلفة من الخلايا العصبية يطلقون النار على الترددات العالية في رشقات نارية متزامنة، وتجنب احتمال أنه قد يكون تدخل التعديلات الوراثية للحيوان مع الفسيولوجية سلوك المحقق يسعى إلى فهم^35،36.

تيسير البروتوكولات المبينة في هذه الورقة تحليل أكثر اكتمالا والتحديد الكمي ل Ca^{2 +} إشارات مسجل من الخلايا في الموقع باستخدام مزيج من الخريطة الزمانية المكانية (STM)-استناداً إلى التحليل والتحليل القائم على الجسيمات. كما وصف البروتوكولات كيف مختلف أنماط Ca^{2 +} الإشارات الملحوظة في خلية مختلفة يمكن تحليل السكان في الموقع المناسب. للتوضيح، الطريقة التي ستدرس Ca^{2 +} الإشارات في عدد سكان متخصصة من الخلايا في الأمعاء الدقيقة، الخلايا فراغي من كيال (المحكمة الجنائية الدولية). المحكمة الجنائية الدولية هي خلايا متخصصة في الجهاز الهضمي (غي) أن المعرض الحيوية داخل الخلايا Ca^{2 +} إشارات، كما تصور استخدام الفئران معربا عن جكامبس^37،،من^{3839،40، ،}من ⁴¹⁴². Ca^{2 +} العابرين في المحكمة الجنائية الدولية المرتبطة بالتنشيط من Ca^{2 +}-تنشيط قنوات (المشفرة بواسطة Ano1) التي تعتبر مهمة في تنظيم استثارة العضلات الملساء المعوية الخلايا (سمكس)^{43، Cl– ،}من ⁴⁴⁴⁵. وهكذا، دراسة Ca^{2 +} إشارات في المحكمة الجنائية الدولية أمر أساسي لفهم حركية الأمعاء. الأمعاء موريني يقدم مثالاً ممتازا لهذه التظاهرة، كما أن هناك فئتين من المحكمة الجنائية الدولية أن تكون مفصولة تشريحيا ويمكن تصور بشكل مستقل: أنا) المحكمة الجنائية الدولية الموجودة في المنطقة الواقعة بين العضلات الملساء الطولية والدائرية طبقات، المحيطة الضفيرة myenteric (المحكمة الجنائية الدولية-بي). هذه الخلايا تعمل كخلايا تنظيم ضربات القلب، وتوليد النشاط الكهربائي المعروف بموجات بطيئة^46،47،،من⁴⁸⁴⁹؛ ثانيا) المحكمة الجنائية الدولية أيضا تقع بين ضفيرة غنية بالمحطات الطرفية للخلايا العصبية الحركية (الضفيرة العضلية العميقة، وبالتالي المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث). هذه الخلايا تعمل كوسطاء ردود على كبيرة الحركية المعوية^37،39،،من⁴⁰⁵⁰. بي-المحكمة الجنائية الدولية والمحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث تختلف شكلياً Ca^{2 +} إشارات سلوكهم تختلف جذريا على إنجاز المهام المحددة. المحكمة الجنائية الدولية-بلدي النجمية في الشكل وتشكل شبكة خلايا المترابطة عن طريق الفجوة تقاطعات^51،52. Ca^{2 +} إشارات في بيان المحكمة الجنائية الدولية-بلدي مختصرة ومترجمة مكانياً Ca^{2 +} الإفراج عن الأحداث التي تقع في مواقع متعددة بشكل متزامن من خلال شبكة بي-المحكمة الجنائية الدولية كتصور داخل فوف (تصويرها مع هدف X 60)³⁸. ويتم تنظيم هذه الإشارات غير متزامن وقتيا في الثانية 1 التكتلات التي، عندما جدولت معا، تصل إلى ارتفاع خلوية s 1 صافي في Ca^{2 +}. هذه الإشارات نشر خلية إلى خلية داخل الشبكة المحكمة الجنائية الدولية وذلك تنظيم Ca^{2 +} إشارات، وتولد من المواقع الفرعية الخلوية، في أنسجة واسعة Ca^{2 +} موجه. تجميع الزمانية والجمع من Ca^{2 +} إشارات في سمي المحكمة الجنائية الدولية-بلدي Ca^{2 +} مجموعات عابرة (ريادية)³⁸. تحدث ريادية إيقاعي (مماثلة تماما مثل المدد الزمنية وفترات مماثلة بين ريادية) 30 مرة في الدقيقة في الماوس. على العكس من ذلك، المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث محور الدوران على شكل خلايا، بعض العمليات الثانوية، التي توزع بين سمكس والعمليات العصبية دوالي ولا بشكل مستقل شبكة^،من⁵¹⁵². بيد أن المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث تشكل تقاطعات الفجوة مع سمكس، وتعمل داخل هذا سينسيتيوم أكبر، المعروف باسم سينسيتيوم المسبار⁵³. Ca^{2 +} إشارات تحدث في مواقع متعددة على امتداد أطوال الخلايا، ولكن لم يتم العالق هذه العابرين أو وقتيا متفاوت المسافات، كما لوحظ في المحكمة الجنائية الدولية-بلدي³⁷. Ca^{2 +} إشارات في المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث تحدث بطريقة عشوائية، مع كثافات متغيرة والمدد الزمنية والمكانية الخصائص. البروتوكولات أدناه، باستخدام مثال Ca^{2 +} إشارات في بلدي-المحكمة الجنائية الدولية والمحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث، وصف تقنيات تحليل إشارات معقدة في أنواع معينة من الخلايا في الموقع. نحن تستخدم النظام ف لوكس Cre إيندوسيبلي للتعبير عن GCaMP6f حصرا في المحكمة الجنائية الدولية، بعد حمل تفعيل Recombinase لجنة المساواة العرقية (Cre) مدفوعا مروج المحكمة الجنائية الدولية محددة (مجموعة أدوات).

Protocol

وكانت جميع الحيوانات المستخدمة والبروتوكولات المضطلع بها في هذه الدراسة وفقا “المعاهد الوطنية للصحة دليل” لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. وافق جميع الإجراءات المؤسسية استخدام الحيوان ورعاية اللجنة في جامعة نيفادا، رينو. 1-جيل فئران KitGCaMP6f عبر Ai95 (RCL-GCaMP6f)-د (الفئرا…

Representative Results

استخدام الفئران كيت-لجنة المساواة العرقية-GCaMP6F (الشكل 1)، دينامية Ca2 + إشارات السلوكيات للمحكمة الجنائية الدولية في الجهاز الهضمي يمكن تصويرها في الموقع. مع الفحص المجهري [كنفوكل]، يمكن الحصول على صور عالية الاستبانة لفئات معينة من السكان للمحكمة الج…

Discussion

Ca^{2 +} تصوير لأنواع محددة من الخلايا داخل أنسجة سليمة أو في شبكات الخلايا غالباً ما تكشف عن أنماط معقدة من Ca^{2 +} العابرين. ويتطلب هذا النشاط تحليلات متأنية ومتعمقة، والتقدير الكمي لالتقاط قدر ممكن من المعلومات عن الأحداث الكامنة والحركية لهذه الأحداث. تحقيق الاستقرار والانتساب وتح…

Materials

Image J software	NIH	1.5a	Image J software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6