Toepassingen van de Spatio-temporele Mapping en analysetechnieken deeltje te kwantificeren intracellulaire Ca2 + signalering In Situ

Summary

Genetisch gecodeerde Ca^{2 +} indicatoren (GECIs) hebben radicaal veranderd hoe in situ Ca^{2 +} imaging wordt uitgevoerd. Maximaliseren van de terugwinning van de gegevens uit deze opnamen, is juiste analyse van Ca^{2 +} signalen vereist. De protocollen in deze paper vergemakkelijken de kwantificering van Ca^{2 +} signalen opgenomen in situ met behulp van Spatio mapping en deeltje gebaseerde analyse.

Abstract

CA^{2 +} beeldvorming van geïsoleerde cellen of specifieke soorten cellen binnen intact weefsels vaak onthult complexe patronen van Ca^{2 +} signalering. Deze activiteit vereist zorgvuldige en grondige analyses en kwantificering te vangen zo veel mogelijk informatie over de onderliggende gebeurtenissen. Ruimtelijke, temporele en intensiteitswaarden intrinsieke tot Ca^{2 +} signalen zoals frequentie, de duur, de voortplanting, de snelheid en de amplitude kunnen bieden sommige biologische informatie die nodig is voor de intracellulaire signalering. Hoge resolutie Ca^{2 +} imaging meestal resultaten in de overname van grote gegevensbestanden die zijn tijdrovend proces in termen van het vertalen van de beeldvorming informatie in meetbare gegevens, en dit proces kan worden vatbaar voor menselijke fouten en bias. Analyse van Ca^{2 +} signalen uit cellen in situ is meestal afhankelijk van eenvoudige intensiteit metingen van willekeurig geselecteerde regio’s van belang (ROI) binnen een beeldveld (FOV). Deze aanpak wordt veel van de belangrijke signalering informatie in de FOV genegeerd. Dus, om te maximaliseren van de terugwinning van gegevens van dergelijke hoge resolutie opnamen verkregen met Ca^{2 +}kleurstoffen of optogenetic Ca^{2 +} imaging, passende ruimtelijke en temporele analyse van de Ca^{2 +} signalen is vereist. De protocollen die worden beschreven in dit artikel zal beschrijven hoe een hoog volume van gegevens kan worden verkregen uit Ca^{2 +} imaging opnamen om meer volledige analyse en kwantificering van Ca^{2 +} signalen opgenomen van cellen met behulp van een combinatie van Spatio kaart (STM)-op basis van de analyse en deeltje gebaseerde analyse. De protocollen ook beschrijven hoe verschillende patronen van Ca^{2 +} signalering waargenomen in andere cel populaties in situ op de juiste wijze kunnen worden geanalyseerd. Ter illustratie wordt zal de methode onderzoeken Ca^{2 +} signalering in een gespecialiseerde bevolking van cellen in de dunne darm, interstitiële cellen van Cajal (ICC), met behulp van GECIs.

Introduction

CA^{2 +} is een alomtegenwoordige intracellulaire boodschapper die een breed scala van cellulaire processen, zoals spier contractie^1,2, metabolisme³, cel proliferatie^3,4, onder controle ⁵, stimulatie van de neurotransmitter release op^6,7van de terminals van de zenuw en activering van transcriptie factoren in de kern. ⁷ intracellulaire Ca^{2 +} signalen vaak de vorm aannemen van voorbijgaande waterstand in cytosolische Ca^{2 +}, en deze kunnen worden spontane of voortvloeien uit agonist stimulatie afhankelijk van de cel type⁸. Ruimtelijke, temporele en intensiteitswaarden intrinsieke tot Ca^{2 +} signalen zoals frequentie, duur, vermeerdering, snelheid en amplitude kunnen de biologische informatie die nodig is voor de intracellulaire signalen^{5, 7 , 9}. cytoplasmatische Ca^{2 +} signalen kunnen ontstaan door de toestroom van Ca^{2 +} vanuit de extracellulaire ruimte of via Ca^{2 +} vrijlating uit het endoplasmatisch reticulum (ER) via Ca^{2 +} release kanalen zoals ryanodine receptoren (RyRs) en inositol-tri-fosfaat receptoren (IP-₃Rs)¹⁰. RyRs en IP-₃Rs kunnen zowel bijdragen tot de generatie van Ca^{2 +} signalen en de gezamenlijke opening van deze kanalen, die gecombineerd met verschillende Ca^{2 +} toestroom mechanismen kan leiden tot een myriade van Ca^{2 +} signalering van patronen die worden gevormd door de nummers en open kans van Ca^{2 +} toestroom kanalen, het profiel van de expressie van Ca^{2 +} release kanalen, de afstand tussen de Ca^{2 +} toestroom en release kanalen, en expressie en distributie van Ca^{2 +} reuptake en extrusie eiwitten. CA^{2 +} signalen kunnen de vorm aannemen van uniforme, langdurige, hoge intensiteit global oscillaties dat voor verscheidene seconden of zelfs minuten duren kan, teeltmateriaal van intracellulaire en intercellulaire Ca^{2 +} golven die intracellulaire afstanden mogen overschrijden meer dan 100 µm^{10,11,12,13,14,15,16}of meer korte, ruimtelijk gelokaliseerde evenementen zoals Ca^{2 +} sparks en Ca^{2 +} soesjes die optreden op tientallen milliseconden tijdschalen en minder dan 5 µm^17,18,19,20te verspreiden.

Fluorescent microscopie is wijd gebruikt om te controleren Ca^{2 +} signalering in geïsoleerde en gekweekte cellen en weefsels intact. Traditioneel, deze experimenten betrokken het gebruik van fluorescerend Ca^{2 +} indicatoren, ratiometric en niet-ratiometric kleurstoffen zoals Fura2, Fluo3/4 of Rhod2, o.a. ^21,22,23. Deze indicatoren werden ontworpen om te worden luchtdoorlatend celmembranen en vervolgens worden gevangen in cellen door het splijten van een ester-groep via endogene esterasen. Binding van Ca^{2 +} de hoge affiniteit indicatoren veroorzaakt veranderingen in fluorescentie wanneer de cellen en weefsels werden verlicht door passende golflengten van licht. Het gebruik van cel permeabele Ca^{2 +} indicatoren verbeterd sterk ons begrip van Ca^{2 +} signalering in levende cellen en toegestaan ruimtelijke resolutie en kwantificering van deze signalen, dat door het analyseren van Ca^{2 +} signalen niet mogelijk was via andere middelen, zoals electrofysiologie. Traditionele Ca^{2 +} indicatoren hebben echter verschillende beperkingen, zoals photobleaching dat over uitgebreide opname perioden^{24 optreedt}. Terwijl de nieuwere Ca^{2 +} indicator kleurstoffen zoals Cal520/590 hebben sterk verbeterde signaal ruisverhoudingen en de mogelijkheid om het detecteren van lokale Ca^{2 +} signalen²⁵, kunnen problemen met photobleaching blijven een zorg voor sommige onderzoekers ^262827,,. Steile photobleaching wordt ook beperkt, de vergroting, aantal Beeldacquisitie, en resolutie die kan worden gebruikt voor opnamen, zoals meer objectieve macht en hogere tarieven van Beeldacquisitie vereisen verhoogd excitatie lichtintensiteit die verhoogt photobleaching.

Deze beperkingen van traditionele Ca^{2 +} indicator kleurstoffen worden verergerd bij het opnemen van Ca^{2 +} signalen ter plaatse, bijvoorbeeld wanneer opname intracellulaire Ca^{2 +} signalen van intact weefsels. Als gevolg van de bovengenoemde problemen, visualisatie van Ca^{2 +} signalen in situ cel permeabele Ca^{2 +} indicatoren is beperkt tot laag vermogen vergroting en verlaagde tarieven van Fotolader, beperken het vermogen van onderzoekers te registreren en stoffelijk of ruimtelijk beperkte subcellular Ca^{2 +} signalen te kwantificeren. Dus, het is al moeilijk te vangen, te analyseren en begrijpen van de complexiteit van het ruimtelijke en temporele van Ca^{2 +} signalen, die van belang zijn in de generatie van gewenste biologische reacties, kunnen zoals hierboven beschreven. Analyse van Ca^{2 +} signalen uit cellen in situ is meestal afhankelijk van eenvoudige intensiteit metingen uit geselecteerde gebieden van belang (ROI) binnen een beeldveld (FOV). De willekeurige keuze van het aantal, de grootte en de positie van ROIs, afhankelijk van de willekeur van de onderzoeker, kan ernstig vertekening van de verkregen resultaten. Evenals de inherente vooringenomenheid met ROI analyse, negeert deze aanpak veel van de belangrijke informatie zoals vervat in de FOV, als dynamische Ca^{2 +} gebeurtenissen binnen een willekeurig gekozen signalering ROI zijn geselecteerd voor analyse. Bovendien, analyse van ROIs mislukt informatie te verstrekken over de ruimtelijke kenmerken van de Ca^{2 +} signalen waargenomen. Bijvoorbeeld, het niet mogelijk onderscheid maken tussen een stijging van Ca^{2 +} die voortvloeien uit een teeltmateriaal Ca^{2 +} Golf en een uiterst gelokaliseerde Ca^{2 +} release evenement van bijhouding van Ca^{2 +} signalen binnen een ROI.

De komst van genetisch gecodeerde Ca^{2 +} indicatoren (GECIs) is radicaal veranderd hoe Ca^{2 +} beeldvorming kan worden uitgevoerd in situ^{29,30,31,32,33} . Er zijn verschillende voordelen aan het gebruik van GECIs over kleurstoffen. Het belangrijkste is misschien dat de expressie van GECI kan worden uitgevoerd op een specifieke wijze van cel, waardoor ongewenste achtergrondverontreiniging uit cellen niet van belang. Een ander voordeel van GECIs ten opzichte van traditionele Ca^{2 +} indicatoren is dat photobleaching wordt verminderd (zoals fluorescentie en éénduidige photobleaching treedt alleen op wanneer cellen actief zijn), in vergelijking met kleurstof-geladen monsters, met name bij hoge vergroting en hoge beeld vastleggen³⁴. Dus, imaging met GECIs, zoals de GCaMP-serie van optogenetic sensoren, biedt onderzoekers de mogelijkheid om opnemen kort, gelokaliseerde sub cellulaire Ca^{2 +} signalen in situ en onderzoeken Ca^{2 +} signalering in cellen binnen hun native omgevingen die eerder niet mogelijk zijn geweest. Herstel van gegevens uit dergelijke hoge resolutie opnamen te maximaliseren, is de juiste ruimtelijke en temporele analyse van de Ca^{2 +} signalen vereist. Opgemerkt moet worden dat terwijl GECIs duidelijke voordelen bieden kan, recente studies is gebleken dat Ca^{2 +} imaging met succes kan worden uitgevoerd vanaf de grote populaties van verschillende soorten neurochemical neuronen gelijktijdig gebruik van conventionele CA^{2 +} indicatoren die niet genetisch zijn gecodeerd in de dierlijke³⁵. Deze aanpak gebruikt post hoc immunohistochemistry te onthullen meerdere verschillende klassen van neuronen afvuren op hoge frequentie in gesynchroniseerde uitbarstingen, en het potentieel dat genetische modificaties aan het dier kunnen hebben bemoeid met de fysiologische vermeden gedrag de onderzoeker wil begrijpen^35,,³⁶.

De protocollen die worden beschreven in dit document vergemakkelijken meer volledige analyse en kwantificering van Ca^{2 +} signalen opgenomen uit cellen in situ met behulp van een combinatie van Spatio kaart (STM)-op basis van de analyse en deeltje gebaseerde analyse. De protocollen ook beschrijven hoe verschillende patronen van Ca^{2 +} signalering waargenomen in andere cel populaties in situ op de juiste wijze kunnen worden geanalyseerd. Ter illustratie wordt zal de methode onderzoeken Ca^{2 +} signalering in een gespecialiseerde bevolking van cellen in de dunne darm, interstitiële cellen van Cajal (ICC). ICC zijn gespecialiseerde cellen in het maagdarmkanaal (GI) die vertonen dynamische intracellulaire Ca^{2 +} signalering, als gevisualiseerd met behulp van muizen GCaMPs^{37,38,39,40, uiten 41,42}. CA^{2 +} transiënten in ICC zijn gekoppeld aan de activering van Ca^{2 +}-geactiveerd Cl^– (gecodeerd door Ano1) kanalen die belangrijk zijn bij het reguleren van de prikkelbaarheid van de intestinale vlotte spier cellen (SMCs)^{43, 44},^,45. De studie van Ca^{2 +} signalering in ICC is dus fundamenteel voor het begrip van de intestinale motiliteit. De lymfkliertest dunne darm biedt een uitstekend voorbeeld voor deze demonstratie vormt en er zijn twee klassen van Internationaal Strafhof dat zijn anatomisch gescheiden en onafhankelijk van elkaar kunnen worden gevisualiseerd: ik) ICC bevinden zich in het gebied tussen de verdienstelijke en cirkelvormige longitudinale gladde spieren lagen, rond de myenteric plexus (ICC-MY). Deze cellen dienen als pacemaker cellen en het genereren van de elektrische activiteit bekend als langzame golven^46,47,48,49; II) ICC liggen ook onder een rijke in de terminals van motorische neuronen (diep gespierde plexus, aldus ICC-DMP) plexus. Deze cellen dienen als bemiddelaars van reacties op zuurbestendige motor transmissie^37,39,40,50. ICC-MY ICC-DMP zijn morfologisch verschillend en hun Ca^{2 +} signalering gedrag radicaal verschillen om hun specifieke taken. ICC-MY Notti in vorm en vormen een netwerk van onderling verbonden cellen via gap kruispunten^51,52. CA^{2 +} signalen in ICC-MY manifest als korte en ruimtelijk gelokaliseerde Ca^{2 +} release gebeurtenissen die zich voordoen op meerdere locaties asynchroon via het ICC-mijn netwerk als gevisualiseerde binnen een FOV (beeld met een 60 X doelstelling)³⁸. Deze asynchrone signalen worden geordend stoffelijk 1 seconde clusters die, wanneer samen tabelvorm, oplopen tot een netto 1 s cellulaire stijging van Ca^{2 +}. Deze signalen doorgeven aan-cel binnen het ICC-netwerk en daarom organiseren Ca^{2 +} signalering, gegenereerd op basis van sub cellulaire sites, in een weefsel breed Ca^{2 +} Golf. Temporele clustering en sommatie van Ca^{2 +} signalen in ICC-MY genoemd Ca^{2 +} voorbijgaande clusters (CTCs)³⁸. CTCs optreden ritmisch (bijvoorbeeld vrij gelijkaardig duur en soortgelijke periodes tussen CTCs) 30 perioden per minuut in de muis. Omgekeerd, ICC-DMP zijn spindel vormige cellen, sommige met secundaire processen, die verdelen tussen SMCs en spataderen zenuw processen en niet zelfstandig vormen een netwerk^51,52. ICC-DMP formulier kloof aansluitingen met SMCs, echter, en de functie binnen dit grotere syncytium, bekend als de SIP syncytium⁵³. CA^{2 +} signalen die zich voordoen op meerdere locaties langs de lengte van de cellen, maar deze transiënten niet entrained of stoffelijk geclusterd, zoals waargenomen in ICC-MY³⁷. CA^{2 +} signalen in ICC-DMP optreden op stochastische wijze, met variabele intensiteit, duur en ruimtelijke kenmerken. De protocollen hieronder, met behulp van het voorbeeld van Ca^{2 +} signalering in ICC-MY en ICC-DMP, technieken voor het analyseren van complexe signalering in specifieke soorten cellen in situ te beschrijven. We gebruikt het afleidbare Cre-Lox p systeem express GCaMP6f uitsluitend in ICC, na inducerende activering van Cre-Recombinase (Cre) gedreven door een specifieke promotor van ICC (Kit).

Protocol

Alle dieren die worden gebruikt en de protocollen die in deze studie uitgevoerd in overeenstemming waren met de nationale instituten van gezondheid gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Alle procedures werden goedgekeurd door het institutionele dier gebruik en Care Comité bij de University of Nevada in Reno. 1. generatie van KitGCaMP6f muizen Cross Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f muizen) en c-Kit+/ Cre-ERT2 (Kit-Cre muizen) voor het genereren van ICC speci…

Representative Results

Met behulp van Kit-Cre-GCaMP6F muizen (Figuur 1), dynamische Ca2 + signalering gedrag van ICC in het maag-darmkanaal kunnen ter plaatse worden beeld. Met confocale microscopie, kunnen resolutieafbeeldingen van specifieke populaties van ICC worden verworven zonder besmetten signalen van andere populaties van ICC binnen de dezelfde weefsel maar in anatomisch verschillende vliegtuigen van focus (figuur 2A)<sup class="xref…

Discussion

CA^{2 +} beeldvorming van specifieke soorten cellen binnen intact weefsels of netwerken van cellen vaak onthult complexe patronen van Ca^{2 +} transiënten. Deze activiteit vereist zorgvuldige en grondige analyses en kwantificering te vangen zo veel mogelijk informatie over de onderliggende gebeurtenissen en kinetiek van deze gebeurtenissen. STM en PTCL analyse worden aangegrepen om de hoeveelheid kwantitatieve gegevens opgeleverd van opnames van dit type te maximaliseren.

De s…

Materials

Image J software	NIH	1.5a	Image J software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6