时空映射和粒子分析技术在细胞内 ca2 +原位信令定量中的应用

Summary

基因编码^{的 ca 2 +}指标 (geci) 从根本上改变了原位 ca^{2 +}成像的执行方式。为了最大限度地从此类记录中恢复数据, 需要对 ca^{2 +}信号进行适当分析。本文的规程利用时空映射和粒子分析, 便于对现场记录的 ca^{2 +}信号进行量化。

Abstract

ca^{2 +}完整组织中分离细胞或特定类型细胞的成像通常揭示 ca^{2 +}信号的复杂模式。这项活动需要仔细和深入的分析和量化, 以获取尽可能多的基础事件信息。ca^{2 +}信号固有的空间、时间和强度参数, 如频率、持续时间、传播、速度和振幅, 可能提供细胞内信号所需的一些生物信息。高分辨率 ca^{2 +}成像通常会导致获取大型数据文件, 这些文件在将成像信息转换为可量化的数据方面非常耗时, 并且此过程容易受到人为错误和偏差的影响。对来自原位细胞的 ca^{2 +}信号的分析通常依赖于来自视场 (fov) 内任意选择的感兴趣区域 (roi) 的简单强度测量。这种方法忽略了 fov 中包含的许多重要信令信息。因此, 为了最大限度地从使用 ca^{2 +}染料或光遗传学 ca^{2 +}成像获得的高分辨率记录中恢复信息, 需要对 ca^{2 +}信号进行适当的空间和时间分析。本文概述的协议将描述如何从 ca^{2 +}成像记录中获得大量数据, 以促进更完整地分析和量化从细胞中记录的 ca^{2 +}信号, 该信号使用基于时空图 (stm) 的分析和基于粒子的分析。这些协议还描述了如何在不同的细胞群中就地观察到的 ca^{2 +}信号的不同模式进行适当的分析。为了说明, 该方法将检查 ca^{2 +}信号在一个专门的群体的细胞在小肠, 间质细胞的 cajal (icc), 使用 gecis。

Introduction

ca2⁺是一种无处不在的细胞内信使, 它控制着广泛的细胞过程, 如肌肉收缩^1,2, 代谢³, 细胞增殖^3,4,5、^刺激神经末梢的神经递质释放 6^,7, 激活细胞核内的转录因子。⁷细胞内 ca^{2 +}信号通常采取的形式, 在细胞质 ca^{2 +}的瞬态升高, 这些可能是自发的或产生的激动剂刺激取决于^{细胞类型 8}。ca^{2 +}信号固有的空间、时间和强度参数, 如频率、持续时间、传播、速度和振幅, 可以提供细胞内信号5所需的生物信息^.7.,9. 细胞质^{ca 2 +}信号可能是由于细胞外空间中的 ca^{2 +}的涌入, 也可能是通过 ca 2⁺释放通道 (er) 从内质网 (er) 中释放的 a^{2 +}释放 (er), 如 ryanodine 受体(ryr) 和肌醇-三磷酸盐受体 (ip 3r)¹⁰。ryr 和 ip_3r都可能有助于 ca^{2 +}信号的生成, 这些通道的协调开放, 再加上各种 ca^{2 +}流入机制, 可能会产生无数的 ca^{2 +}信号模式由 ca^{2 +}流入通道的数量和开放概率、ca^{2 +}释放通道的表达谱、ca^{2 +}流入和释放通道之间的接近度以及 ca 2 的表达式和分布所塑造的.⁺再摄取和挤出蛋白。ca^{2 +}信号的形式可能是均匀、持久、高强度的全球振荡, 可能持续几秒钟甚至几分钟, 传播细胞内和细胞内的 ca 2⁺波, 这些波可能跨越细胞内的距离超过 100μm^10、11、12、^13、14、¹⁵、¹⁶或更简短的空间本地化事件, 如 ca^{2 +}火花和 ca^{2 +}喷口发生在几十毫秒的时间尺度上, 传播小于 5μm^{17、18、19、20}。

荧光显微镜已被广泛用于监测 ca^{2 +}信号在分离和培养的细胞和完整的组织。传统上, 这些实验涉及使用荧光 ca^{2 +}指示器、比率和非比率染料, 如 fura2、fluo 或 rhod2 等^{, 以及21、22、23}。这些指标被设计成可渗透到细胞膜, 然后通过内源性酯酶被酯组的裂解困在细胞中。当细胞和组织被适当波长的光照射时, ca^{2 +}与高亲和力指标的结合会导致荧光的变化。细胞渗透性 ca^{2 +}指标的使用极大地增进了我们对活细胞中 ca^{2 +}信号的理解, 并允许通过检测 ca^{2 +}信号来实现这些信号的空间分辨率和量化通过其他手段, 如电生理。但是, 传统的 ca^{2 +}指标有几个限制, 例如在较长的记录周期^内发生的光漂白24。虽然较新的 ca^{2 +}指示染料 (如 cal520/ad990) 大大提高了信噪比和检测局部 ca^{2 +}信号²⁵的能力, 但光漂白问题仍然是一些研究人员^{关注的问题26,27,28}。缓慢的光漂白还限制了可用于录制的放大倍率、图像采集速率和分辨率, 因为增加的目标功率和更高的图像采集速率需要增加激发光强度, 而增加光漂白。

传统 ca^{2 +}指示染料的这些局限性在现场记录 ca^{2 +}信号时 (例如, 在记录来自完整组织的细胞内 ca^{2 +}信号时) 会加剧。由于上述问题, 使用细胞渗透 ca 2 + 指示器^就地显示 ca^{2 +}信号仅限于低功耗放大倍率和降低图像捕获率, 限制了调查人员记录和记录图像的能力。量化时间或空间上受限的亚细胞 ca^{2 +}信号。因此, 很难捕获、分析和欣赏 ca^{2 +}信号的空间和时间复杂性, 这在生成所需的生物响应时非常重要, 如上文所述。对来自原位细胞的 ca^{2 +}信号的分析通常依赖于来自视场 (fov) 范围内选定感兴趣区域 (roi) 的简单强度测量。任意选择 roi 的数量、大小和位置, 取决于研究人员的一时冲动, 会严重偏向所获得的结果。除了投资回报率分析的固有偏差外, 这种方法忽略了 fov 中包含的许多重要信令信息, 因为选择任意选择的 roi 中的动态 ca^{2 +}事件进行分析。此外, 对 roi 的分析未能提供有关所观察到的 ca^{2 +}信号的空间特性的信息。例如, 可能无法区分由传播的 ca 2⁺波引起的 ca^{2 +}的上升和高度本地化的 ca^{2 +}释放事件与 roi 内 ca^{2 +}信号的表格。

基因编码 ca^{2 +}指标 (gecis) 的出现从根本上改变了 ca^{2 +}成像在^{现场进行29、30、31、32、33的}方式.与染料相比, 使用 geci 有几个优点。也许最重要的是, geci 的表达可以以细胞特定的方式进行, 从而减少不感兴趣的细胞不必要的背景污染。与传统的 ca^{2 +}指标相比, geci 的另一个优点是光漂白减少 (因为与染色样品相比, 只有在细胞处于活动状态时才会出现荧光和随之而产生的光漂白), 尤其是在高的情况下放大倍率和高图像捕获率³⁴。因此, 利用 gecis 成像, 例如 gcam 系列光成因传感器, 使研究人员能够在现场记录简短的、局部的亚细胞 ca^{2 +}信号, 并在其细胞内研究 ca^{2 +}信号。以前无法实现的本机环境。为了最大限度地从这种高分辨率记录中恢复信息, 需要对 ca^{2 +}信号进行适当的空间和时间分析。需要注意的是, 虽然 geci 可以提供一些明显的优势, 但最近的研究表明, ca^{2 +}成像可以成功地从不同神经化学类的神经元的大量人群中成功地使用传统的ca^{2 +}指标, 不是基因编码到动物³⁵。这种方法使用后组织化, 以揭示多个不同类别的神经元在同步爆发中在高频放电, 并避免了对动物的基因改造可能干扰生理的可能性调查人员试图理解^35,36的行为。

本文概述的方案有助于更完整地分析和量化 ca 2 + 信号记录从细胞就地使用相结合的时空^{图 (} stm) 基于分析和粒子分析。这些协议还描述了如何在不同的细胞群中就地观察到的 ca^{2 +}信号的不同模式进行适当的分析。为了说明, 该方法将检查 ca^{2 +}信号在一个专门的人群的细胞在小肠, 间质细胞的 cajal (icc)。icc 是胃肠道 (gi) 中的特殊细胞, 表现出动态的细胞内 ca^{2 +}信号, 可视化使用小鼠表达 gcam^37,38,³⁹,^{40, 41,42}。ca^{2 +}瞬态连接到激活 ca^{2 +}激活 cl^通道(由ano1编码), 这对于调节肠道平滑肌细胞 (smc)⁴³的兴奋性非常重要^{, 44,45}。因此, 在 icc 中研究 ca^{2 +}信号是理解肠道运动的基础。小鼠小肠为这次演示提供了一个很好的例子, 因为有两类 icc 是解剖分离的, 可以独立地可视化: i) icc 位于圆形和纵向平滑肌之间的区域层, 周围的肠系膜神经丛 (icc-my)。这些细胞作为起搏器细胞, 并产生被称为慢波^46,47,48,49的电活动^;ii) icc 也位于一个神经丛中, 具有丰富的运动神经元 (深肌神经丛, 因此 icc-dmp) 的终端。这些细胞是对肠道运动神经传递的反应的介质 37^,39,40,50。icc-my 和 icc-dmp 在形态上是不同的, 它们^{的 ca 2 +}信令行为在完成其特定任务时具有根本的差异。icc-my 被星状, 并通过间隙^{连接 51, 52 形成}一个相互连接的单元网络。icc-my 中的 ca^{2 +}信号为简短且空间本地化的 ca^{2 +}释放事件, 通过 icc-my 网络异步发生在多个站点上, 在 fov (以60x 目标进行成像)^中可视化。这些异步信号被临时组织成1秒的集群, 如果一起制表, 相当于 ca2 + 中净 1^的细胞上升。这些信号在 icc 网络内从细胞传播, 从而将从亚细胞位点生成的 ca^{2 +}信号组织到组织宽 ca^{2 +}波中。icc-my 中 ca^{2 +}信号的时间聚类和求和被称为 ca^{2 +}瞬态聚类 (ctc)³⁸。ctc 有节奏地发生 (例如, 在小鼠体内每分钟发生30次类似的持续时间和类似的 ctc 之间的时间)。相反, icc-dmp 是纺锤形细胞, 有的具有二次处理, 分布在 smc 和静脉曲张神经过程之间, 并不独立形成网络^51,52。然而, icc-dmp 形成与 smc 的缝隙连接, 并在这个更大的合胞体 (称为 sip 合胞⁵³) 中发挥作用。ca^{2 +}信号发生在细胞长度沿线的多个点, 但这些瞬态并不被夹带或暂时聚集, 正如在 icc-my^{37 中}观察到的那样。icc-dmp 中的 ca^{2 +}信号以随机方式发生, 具有不同的强度、持续时间和空间特征。下面的协议, 使用 icc-my 和 icc-dmp 中的 ca^{2 +}信令示例, 描述了在特定类型的原位细胞中分析复杂信号的技术。我们利用诱导 cre-lox p 系统在 icc 中专门表达 gmp6f, 在诱导由 icc 特定启动子 (kit) 驱动的 Cre-Lox 酶 (cre) 激活后。

Protocol

本研究中使用的所有动物和执行的协议都符合国家实验室动物护理和使用健康研究所的规定。所有程序都得到了里诺内华达大学动物使用和护理机构委员会的批准。 1. kitgamp6f 小鼠的产生 cross ai95 (rcl-gmp6f)-d (gmp6f 小鼠) 和 c-kit+ cre-ert2 (kit-cree) 生成 icc 特定 gmp6f 表示动物 (kit-cre-gmp6-小鼠)。请注意:GCaMP6f 的使用是由于其报告的效率, 在局部, 短暂的?…

Representative Results

利用 kit-cre-gmcmp6f 小鼠 (图 1), 可以对 icc 在胃肠道中的动态 ca2 +信号行为进行原位成像。通过共聚焦显微镜, 可以在不污染来自 icc 其他种群的信号的情况下获得 icc 特定种群的高分辨率图像, 但在解剖上不同的焦点平面上 (图 2a)37,39,40,<sup class…

Discussion

ca^{2 +}对完整组织内或细胞网络内特定类型细胞的成像通常揭示 ca^{2 +}瞬态的复杂模式。这项活动需要认真和深入的分析和量化, 以获取尽可能多的关于这些事件的基本事件和动力学的信息。stm 和 ptcl 分析提供了一个机会, 最大限度地增加了从这种类型的录音中获得的定量数据的数量。

icc-dmp 的窄纺锤形形态使其非常适合从上述 stm 中获得的 stm 分析。但是, 此分析?…

Materials

Image J software	NIH	1.5a	Image J software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6