Kendisinin geçici eşleme ve parçacık analiz teknikleri intrasellüler Ca sinyal2 + in Situ ölçmek için uygulamaları

Summary

Genetik olarak kodlanmış Ca^{2 +} göstergeleri (turk) nasıl yerinde Ca^{2 +} görüntüleme gerçekleştirilir kökten değişti. Veri kurtarma gibi kayıtları en üst düzeye çıkarmak için Ca^{2 +} sinyal uygun analiz gereklidir. Bu kağıt Protokoller’de Ca sinyalleri^{2 +} yerinde kronolojik zamanmekansal haritalama ve analiz parçacık tabanlı kullanarak kaydedilen miktar kolaylaştırmak.

Abstract

Kez CA^{2 +} görüntüleme izole hücre veya hücreleri sağlam dokularda belirli türleri Ca^{2 +} sinyal karmaşık desenler ortaya koymaktadır. Bu etkinlik dikkatli ve ayrıntılı analizler ve temelindeki olayları hakkında mümkün olduğunca fazla bilgi yakalamak için miktar gerektirir. Spatial, zamansal ve yoğunluk parametreleri içsel Ca^{2 +} sinyalleri sıklığı, süresi, yayma, hız ve genlik gibi hücre içi sinyal için gerekli bazı biyolojik bilgi sağlayabilir. Genellikle zaman ölçülebilir veri görüntüleme bilgileri çeviri açısından süreci ve bu sürecin alıcı veri dosyaları edinimi sonuçlarında Imaging yüksek çözünürlüklü Ca^{2 +} insan hatası ve önyargı duyarlı olabilir. Ca^{2 +} sinyalleri hücrelerden yerinde analizi genellikle faiz (ROI) görüş (FOV) bir alan içinde keyfi olarak seçilen bölgelerinden basit yoğunluk ölçümleri kullanır. Bu yaklaşım çok FOV içinde yer alan önemli sinyal bilgilerin dikkate almaz. Böylece, Ca^{2 +}boya veya optogenetic Ca^{2 +} ile elde edilen yüksek çözünürlüklü böyle kayıtlarından bilgi kurtarma maksimize etmek için görüntüleme, uygun kayma ve zamansal Analizi Ca^{2 +} sinyalleri gereklidir. Bu makalede özetlenen protokolleri nasıl veri büyük miktarda daha kapsamlı analiz ve miktar bir birleşimini kullanarak hücrelerinden kaydedilen Ca^{2 +} sinyal kolaylaştırmak için Ca^{2 +} görüntü kayıtlarından elde edilebilir anlatacağım zamanmekansal harita (STM)-tabanlı analiz ve parçacık tabanlı analiz. İletişim kuralları ayrıca nüfus yerinde uygun şekilde çözümlenebilir farklı hücresinde gözlenen sinyal Ca^{2 +} ne kadar farklı desenler açıklar. Gösterim amacıyla, yöntem hücrelerde ince bağırsak, interstisyel hücreleri turk kullanarak, Cajal (ICC), özel bir nüfus içinde sinyal Ca^{2 +} muayene edecektir.

Introduction

CA^{2 +} hücresel süreçler, kas kasılması^1,2, metabolizma³, hücre proliferasyonu^3,4, gibi geniş bir kontrol eden her yerde birden bulunan hücre içi haberci bir ⁵, sinir terminallerine^6,7‘ nörotransmitter piyasaya uyarılması ve harekete geçirmek-in transkripsiyon faktörleri çekirdeğinde. ⁷ intrasellüler Ca^{2 +} kez geçici yükselmeler sitozolik Ca^{2 +}‘ biçiminde ve bunlar kendiliğinden veya agonist stimülasyon bağlı olarak hücre türü⁸kaynaklanan sinyalleri. Spatial, zamansal ve yoğunluk parametreleri içsel Ca^{2 +} sinyalleri sıklığı, süresi, yayma, hız ve genlik gibi hücre içi sinyal verme⁵için^, gerekli biyolojik bilgi verebilir misiniz ^{7 , 9}. sitoplazmik Ca^{2 +} sinyalleri neden olur akını Ca^{2 +} hücre dışı uzaydan veya Ca^{2 +} sürümü endoplazmik retikulum (ER) ile gelen Ca^{2 +} yayın kanalları gibi ryanodine reseptörleri üzerinden (RyRs) ve inositol-tri-fosfat reseptörleri (IP₃Rs)¹⁰. RyRs ve IP₃Rs hem de Ca^{2 +} sinyalleri nesile katkıda bulunabilir ve çeşitli Ca^{2 +} akını mekanizmaları ile birlikte bu kanallar uyumlu açılış desenleri sinyalizasyon Ca^{2 +} içinde sayısız yol açabilir Bu rakamlara göre şekillenir ve olasılık ifade profil Ca^{2 +} akını ve yayın kanalları ve ifade ve Ca^{2 dağılımı arasındaki yakınlık Ca2 + Kanal yayın, Ca2 + kanal akın, açık +} geri alım ve ekstrüzyon proteinler. CA^{2 +} sinyalleri uzun ömürlü, Üniforma, birkaç saniye veya dakika bile, hücre içi mesafeler çapraz olabilir hücre içi ve hücreler arası Ca^{2 +} dalgalarının yayılmasını sürebilir yüksek yoğunluklu küresel salınımlarını şeklinde olabilir 100’den fazla µm^{10,11,12,13,14,15,16}veya daha fazla Ca^{2 + gibi dağınık şekilde yerelleştirilmiş olaylar kısa} kıvılcım ve milisaniyelik zaman çizelgelerine onlarca üzerinde ortaya ve 5’ten µm^17,18,19,20yaymak Ca^{2 +} puffs.

Floresan mikroskopi izole ve kültürlü hücreleri ve sağlam dokulara sinyalizasyon Ca^{2 +} izlemek için yaygın olarak kullanılmış. Geleneksel olarak, bu deneyler floresan Ca^{2 +} göstergeleri, ratiometric kullanımı dahil ve sigara ratiometric gibi Fura2, Fluo3/4 ya da Rhod2, diğerleri arasında ^21,22,23boyuyor. Bu göstergeler hücre membran geçirgen ve sonra hücrelerde endojen esterazlar üzerinden bir ester grubu bölünme tarafından tuzak haline için dizayn edilmiştir. Hücre ve dokulara uygun dalga boylarında ışık tarafından aydınlatılmış Ca^{2 +} yüksek afinite göstergeleri için bağlama değişiklikleri floresans içinde neden oldu. Geçirgen Ca göstergeleri^{2 +} hücre kullanımı oldukça bizim anlayış yaşayan hücreleri sinyal ve uzaysal çözünürlük ve Ca^{2 +} sinyalleri raporlaması tarafından mümkün değildi miktar bu sinyallerin izin Ca^{2 +} gelişmiş Elektrofizyoloji gibi diğer yollarla. Ancak, geleneksel Ca^{2 +} göstergeleri genişletilmiş kayıt dönemleri²⁴üzerinde oluşan photobleaching gibi bazı sınırlamaları vardır. Cal520/590 gibi büyük ölçüde geliştirilmiş sinyal noise oranları ve yerel Ca^{2 +} sinyalleri²⁵algılama yeteneğini daha yeni Ca^{2 +} göstergesi Boyayıcılar, photobleaching ile ilgili sorunlar hala bazı araştırmacılar ^{için bir endişe kalır 26,27,28}. Sarp photobleaching da büyütme oranı resim alma, kısıtlar ve artan nesnel güç ve resim alma daha yüksek oranda gerektiği, kayıtları için kullanılabilecek çözünürlük uyarma ıșık yoğunluğu artmış bu photobleaching artırır.

Bu sınırlamaları geleneksel Ca^{2 +} göstergesi boyalar Ca^{2 +} sinyalleri in situ olarak kaydederken şiddetlenir, örneğin ne zaman kayıt intrasellüler Ca^{2 +} sağlam dokulardan sinyalleri. Yukarıdaki sorunları nedeniyle görselleştirme sinyallerin Ca^{2 +} hücre geçirgen Ca^{2 +} göstergeler kullanarak in situ düşük güç büyütme için sınırlı edilmiş ve görüntü yakalama, müfettişler kaydetmek için yetenek zorlayıcı indirdi ve geçici veya dağınık şekilde sınırlı hücre altı Ca^{2 +} sinyalleri ölçmek. Böylece, yakalama, analiz ve yukarıda belirtildiği gibi istenen biyolojik yanıt, üretimi önemli olabilir Ca^{2 +} sinyalleri, kayma ve temporal karmaşıklığı takdir etmek zor oldu. Ca^{2 +} sinyalleri hücrelerden yerinde analizi genellikle faiz (ROI) görüş (FOV) bir alan içinde seçilen bölgelerinden basit yoğunluk ölçümleri kullanır. Sayısı, boyutu ve konumunu ROIs, araştırmacı, kapris bağımlı rasgele seçimi ciddi bir şekilde elde edilen sonuçları önyargı. Yatırım getirisi analizi ile doğal önyargı yanı sıra bu yaklaşım çok önemli dikkate almaz FOV, dinamik Ca^{2 +} olayları bir keyfi olarak seçilen içinde bulunan bilgi sinyal ROI seçilir analiz için. Ayrıca, ROIs Analizi gözlenen Ca^{2 +} sinyalleri mekansal özellikleri hakkında bilgi sağlamak başarısız olur. Örneğin, mümkün olmayabilir bir artış bir yayılmasını kaynaklanan Ca^{2 +} ayırt etmek için Ca^{2 +} sinyal bir yatırım getirisi içinde hesaplamalar olayından Ca^{2 +} dalga ve bir çok yerelleştirilmiş Ca^{2 +} serbest.

Genetik olarak kodlanmış Ca^{2 +} göstergeleri (turk) gelişiyle kökten nasıl Ca^{2 +} görüntüleme gerçekleştirilen in situ^{29,30,31,32,33 olabilir değişti} . Turk boyalar üzerinde kullanarak birkaç avantajı vardır. En önemli belki de GECI ifade hücreleri istenmeyen arka plan kirlenme değil ilgi azaltan bir hücre belirli bir şekilde, gerçekleştirilebilir olduğunu. O photobleaching azalır geleneksel Ca^{2 +} göstergeleri turk başka bir avantajı olduğunu (floresan ve dolayısıyla photobleaching sadece gerçekleştiği sırada ne zaman hücreleri aktif), özellikle de yüksek boya yüklü örnekleri ile karşılaştırıldığında büyütme ve görüntü yüksek oranda³⁴yakalayın. Böylece, optogenetic sensörler, GCaMP dizi tanıyor gibi müfettişler kaydetmek için yetenek Turk ile görüntüleme ve kısa, yerelleştirilmiş alt hücresel Ca^{2 +} in situ sinyalleri içindeki hücreleri sinyal Ca^{2 +} araştırmak onların daha önce mümkün olmamıştır doğal ortamlar. Böyle yüksek çözünürlüklü kayıtlarından bilgi kurtarılması en üst düzeye çıkarmak için Ca^{2 +} sinyalleri uygun kayma ve zamansal analizi gereklidir. Turk bazı avantajları açık sunabilir iken, son yıllarda yapılan çalışmalarda Ca^{2 +} görüntüleme başarıyla aynı anda geleneksel kullanarak nöronların farklı nörokimyasal sınıfların büyük nüfus gerçekleştirilmesi indirdik ki unutulmamalıdır Hayvan³⁵genetik olarak kodlanmış değil Ca^{2 +} göstergeleri. Bu yaklaşım öğleden hoc immünhistokimya yüksek frekans eşitlenmiş öbek halinde ateş nöronların birden çok farklı sınıflar ortaya çıkarmak için kullanılan ve hayvan genetik değişiklikler fizyolojik ile müdahale potansiyel kaçınılması ^35,36anlamak için davranış araştırmacı çalışmaktadır.

Bu makalede özetlenen protokolleri daha kapsamlı çözümlemesini kolaylaştıran ve Ca^{2 +} miktar sinyalleri kaydedilen hücrelerden yerinde kronolojik zamanmekansal harita (STM) bir birleşimini kullanarak-tabanlı analiz ve parçacık tabanlı analiz. İletişim kuralları ayrıca nüfus yerinde uygun şekilde çözümlenebilir farklı hücresinde gözlenen sinyal Ca^{2 +} ne kadar farklı desenler açıklar. Gösterim amacıyla, yöntem hücrelerde ince bağırsak, interstisyel hücreleri Cajal (ICC) özel bir nüfus içinde sinyal Ca^{2 +} muayene edecektir. ICC sinyal, dinamik intrasellüler Ca^{2 +} sergi fareler GCaMPs^{37,38,39,40ifade kullanarak görüntülenir gibi özel hücreler gastrointestinal (GI) sistem içinde vardır, 41,42}. CA^{2 +} geçişler ICC içinde harekete geçirmek-in Ca^{2 +}için bağlı-Cl^– bağırsak düz kas hücreleri (SMCs)^{43, uyarılabilirlik düzenlenmesinde önemlidir ( Ano1tarafından kodlanmış) kanalları aktive 44,45}. Böylece, ICC içinde sinyal Ca^{2 +} bağırsak hareketliliği anlamak için temel bir çalışmadır. ICC anatomik olarak ayrılmış ve bağımsız olarak görüntülenmiştir iki sınıf olarak fare bağırsağı bu gösteri için mükemmel bir örnek sunar: Ben) ICC dairesel ve boyuna düz kas arasındaki bölgede yer alan katmanları, myenteric pleksus çevreleyen (ICC MY). Bu hücreler kalp pili hücreleri olarak hizmet ve yavaş dalgalar^46,47,48,49bilinen elektrik etkinliği oluşturduğunu; II) ICC ayrıca bir pleksus motor nöronlar (derin kas pleksus, böylece ICC DMP) terminalleri içinde zengin arasında yer vardır. Bu hücreler enterik motor neurotransmission^37,39,40,50tepkilerin arabulucu olarak hizmet vermektedir. ICC MY ICC DMP morfolojik ayrı ve Ca^{2 +} sinyal davranışları onların belirli görevleri yerine getirmek için kökten farklıdır. ICC MY şeklinde yildiz seklinde ve birbirine bağlı hücre boşluğu kavşak^51,52üzerinden bir ağ oluştururlar. CA^{2 +} zaman uyumsuz olarak görüntülenmeyecektir FOV (60 X amacı ile görüntüsü)³⁸içinde olarak ICC benim ağ üzerinden birden çok site oluşan kısa ve dağınık şekilde yerelleştirilmiş Ca^{2 +} yayın olaylar olarak ICC MY bildiriminde sinyalleri. Bu zaman uyumsuz sinyalleri geçici düzenlenmiştir 1 saniye kümeleri, net 1 s hücresel artış Ca^{2 +}birlikte tablo zaman tutar. Bu sinyaller hücre hücre ICC ağ içinde yayar ve bu nedenle sinyal, alt hücresel sitelerden bir doku geniş Ca^{2 +} dalga oluşturulan Ca^{2 +} düzenlemek. Zamansal kümeleme ve Ca^{2 +} özetlemesi sinyalleri içinde ICC MY Ca^{2 +} geçici kümeleri (CTCs)³⁸olarak adlandırdığı. CTCs ritmik 30 dakikada kez fare (örneğin oldukça aynı süreye ve CTCs arasında benzer dönemleri) oluşur. Diğer taraftan, ICC DMP şeklinde iğ hücreleri, bazı SMCs ve varisli sinir işlemler arasında dağıtmak ve bağımsız olarak ikincil süreçleri ile bir ağ^51,52oluştururlar. ICC DMP formu boşluğu kavşak ile SMCs, ancak ve işlev SIP syncytium⁵³bilinen bu büyük syncytium içinde. Hücreleri uzunlukları boyunca birden çok site CA^{2 +} sinyalleri oluşur, ancak bu geçişler değil entrained veya geçici kümelenmiş, ICC MY³⁷içinde gözlemlediği gibi. CA^{2 +} sinyalleri ICC DMP içinde değişken yoğunluklarını, süreleri ve mekansal özellikleri ile Stokastik bir şekilde meydana gelir. ICC-MY içinde sinyal Ca^{2 +} örneği kullanarak aşağıda iletişim kuralları ve ICC-DMP, hücreler in situ olarak belirli türde karmaşık sinyal analiz teknikleri açıklar. Biz indüklenebilir Cre-Lox p Sistem aktivasyonu Cre-Recombinase (Cre) bir ICC belirli düzenleyici (Kit) tarafından tahrik inducing sonra ICC, içinde sadece GCaMP6f ifade etmek için kullanılmaktadır.

Protocol

Bütün hayvanlar kullanılan ve bu çalışmada yürütülen iletişim kuralları uyarınca Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları… Tüm yordamları kurumsal hayvan kullanımı ve bakımı Komitesi, University of Nevada, Reno tarafından kabul edildi. 1. nesil KitGCaMP6f fareler Ai95 cross (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f fareler) ve c-Kit+/ Cre-ERT2 (Kit-Cre fareler ICC belirli GCaMP6f ifade hayvanlar (Kit-Cre-GCaMP6f fareler) oluştur…

Representative Results

Kit-Cre-GCaMP6F fareler (Şekil 1), gastrointestinal sistem ICC davranışlarını yerinde yansıma sinyali dinamik Ca2 + kullanarak. Confocal mikroskobu ile ICC belirli nüfusun yüksek çözünürlüklü görüntüler aynı doku içinde ancak odak (Şekil 2A)37 anatomik olarak farklı uçaklarda ICC diğer nüfus gelen sinyalleri bulaşıcı olmadan elde edilebilir , <sup class="xre…

Discussion

Kez CA^{2 +} görüntüleme olan belirli hücreleri sağlam dokularda veya ağları hücre içerisinde Ca^{2 +} geçişler karmaşık desenler ortaya koymaktadır. Bu etkinlik dikkatli ve ayrıntılı analizler ve temelindeki olayları ve bu olayların kinetik hakkında mümkün olduğunca fazla bilgi yakalamak için miktar gerektirir. STM ve PTCL analiz bu tür kayıtları vermiştir nicel veri miktarını en üst düzeye çıkarmak için bir fırsat sağlar.

Dar, iğ şeklind…

Materials

Image J software	NIH	1.5a	Image J software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6