Applications de cartographie spatio-temporelle et Techniques d’analyse des particules pour quantifier la signalisation intracellulaire Ca2 + In Situ

Summary

Ca^{2 +} indicateurs génétiquement encodés (GECIs) ont radicalement changé comment in situ Ca^{2 +} imagerie est réalisée. Pour optimiser la récupération de données de ces enregistrements, il faut une analyse appropriée des signaux de Ca^{2 +} . Les protocoles dans le présent document facilitent la quantification de Ca^{2 +} des signaux enregistrés sur place à l’aide de la cartographie spatio-temporelle et analyse axée sur les particules.

Abstract

Ca^{2 +} imagerie de cellules isolées ou de types spécifiques de cellules dans les tissus intacts souvent révèle des motifs complexes de signalisation Ca^{2 +} . Cette activité nécessite une analyse attentive et approfondie et quantification de capturer autant d’informations que possible sur les événements sous-jacents. Spatial, temporel et intensité paramètres intrinsèques aux signaux de Ca^{2 +} comme fréquence, durée, propagation, vitesse et l’amplitude peuvent fournir certaines informations biologiques requises pour signalisation intracellulaire. Haute résolution Ca^{2 +} imagerie typiquement résultats dans l’acquisition des fichiers de données volumineux qui prennent beaucoup de temps au processus en termes de traduire l’information d’imagerie en données quantifiables et ce processus peuvent être sensibles à la partialité et l’erreur humaine. Analyse des signaux de Ca^{2 +} des cellules in situs s’appuie généralement sur les mesures d’intensité simple d’arbitrairement certaines régions d’intérêt (ROI) dans un champ de vision (FOV). Cette approche ignore une grande partie des signalisation des informations importantes contenues dans le champ de vision. Ainsi, afin de maximiser la récupération d’informations provenant de ces enregistrements haute résolution obtenue avec Ca^{2 +}colorants ou optogenetic Ca^{2 +} , d’imagerie, il conviendra d’analyse spatiale et temporelle des signaux^{2 +} Ca est requis. Les protocoles décrits dans le présent document décrira comment un volume élevé de données peut provenir de Ca^{2 +} imageries enregistrements pour faciliter l’analyse plus complète et la quantification des signaux^{2 +} Ca enregistrés à partir de cellules en utilisant une combinaison de carte spatio-temporelle (STM)-fonction analyse et analyse axée sur les particules. Les protocoles décrivent également comment les différents modèles de Ca^{2 +} signalisation observés dans différentes cellules in situ des populations peuvent être analysées de façon appropriée. À titre d’exemple, la méthode examinera Ca^{2 +} signalisation dans une population spécialisée des cellules dans l’intestin, cellules interstitielles de Cajal (CIC), à l’aide de GECIs.

Introduction

Ca^{2 +} est un messager intracellulaire ubiquitaire qui contrôle une large gamme de processus cellulaires, comme le muscle contraction^1,2,³de métabolisme, cellule prolifération^{3,4, 5}, stimulation de la libération des neurotransmetteurs au nerf bornes^6,7et l’activation de la transcription factors dans le noyau. ⁷ Ca intracellulaire^{2 +} signale souvent prendre la forme d’élévations transitoires cytosolique Ca^{2 +}, et ceux-ci peuvent être spontanées ou résultent d’une stimulation agoniste selon le type de cellule⁸. Spatial, temporel et paramètres d’intensité intrinsèques de Ca^{2 +} signaux tels que la fréquence, la durée, propagation, vitesse et amplitude peuvent fournir les informations biologiques nécessaires à la signalisation intracellulaire^{5, 7 , 9}. cytoplasmique Ca^{2 +} signaux peuvent résulter de l’influx de Ca^{2 +} de l’espace extracellulaire ou par libération de Ca^{2 +} du réticulum endoplasmique (re) par l’intermédiaire de canaux de Ca^{2 +} libération tels que les récepteurs de la ryanodine (RyRs) et des récepteurs de l’inositol-triphosphate (IP₃Rs)¹⁰. RyRs et IP₃Rs peuvent tous deux contribuent à la génération de signaux de Ca^{2 +} et l’ouverture concertée de ces canaux, ce qui combiné à divers mécanismes de Ca^{2 +} afflux peut entraîner une myriade de Ca^{2 +} modèles de signalisation qui sont façonnés par les nombres et ouvrir la probabilité des canaux Ca^{2 +} afflux, le profil d’expression des canaux Ca^{2 +} libération, la proximité entre l’influx de Ca^{2 +} et des canaux de libération et expression, répartition du Ca^{2 +} protéines recaptage et extrusion. Ca^{2 +} signaux peuvent prendre la forme d’uniforme, longue durée, oscillations global de haute intensité qui peut durer pendant plusieurs secondes ou minutes même, multiplication intracellulaires et intercellulaires Ca^{2 +} vagues pouvant traverser des distances intracellulaires plus de 100 µm^{10,11,12,13,14,15,16}, ou des événements plus brèves, localisées dans l’espace comme Ca^{2 +} sparks et Ca^{2 +} bouffées qui se produisent sur des dizaines de milliseconde échelles de temps et la propagation de moins de 5 µm^17,18,19,20.

Microscopie de fluorescence a été utilisée largement pour surveiller Ca^{2 +} signalisation dans les cellules isolées et cultivées et dans les tissus intacts. Traditionnellement, ces expériences comportait l’utilisation de fluorescent Ca^{2 +} indicateurs, ratiométrique et non-ratiométrique colorants tels que Fura2, Fluo3/4 ou Rhod2, entre autres, ^21,22,23. Ces indicateurs ont été conçus pour être perméable aux membranes cellulaires et puis piégé dans les cellules par le clivage d’un groupe ester par des estérases endogènes. Fixation du Ca^{2 +} pour les indicateurs de haute affinité cause des changements dans la fluorescence lorsque les cellules et les tissus ont été éclairés par des longueurs d’onde de lumière. L’utilisation de cellules perméables Ca^{2 +} indicateurs grandement amélioré notre compréhension de Ca^{2 +} signalisation dans les cellules vivantes et permis la résolution spatiale et la quantification de ces signaux qui n’a pas été possible en testant des signaux de Ca^{2 +} par d’autres moyens, tels que de l’électrophysiologie. Cependant, Ca^{2 +} indicateurs traditionnels présentent plusieurs limites, telles que le Photoblanchiment qui se produit au cours de l’enregistrement de longues périodes²⁴. Tandis que l’indicateur^{2 +} Ca nouveaux colorants tels que Cal520/590 ont grandement amélioré signal aux rapports de bruit et de la capacité à détecter des locaux Ca^{2 +} signaux²⁵, problèmes avec le Photoblanchiment peuvent rester encore un sujet de préoccupation pour certains chercheurs ^2627,de^,28. Photoblanchiment précipité limite également le grossissement, le taux d’acquisition d’image, et résolution qui peut être utilisée pour des enregistrements, comme le besoin d’augmenter la puissance objective et des taux plus élevés d’acquisition d’images a augmenté l’intensité lumineuse excitation qui augmente le Photoblanchiment.

Ces limitations de traditionnel Ca^{2 +} indicateur colorants sont exacerbées lors de l’enregistrement des signaux^{2 +} Ca in situ, par exemple lorsque enregistrement intracellulaire Ca^{2 +} des signaux de tissus intacts. En raison des problèmes ci-dessus, visualisation de signaux^{2 +} Ca in situ à l’aide de cellules perméables Ca^{2 +} indicateurs a été limitée à un grossissement de faible puissance et réduit les taux de capture d’image, limitant la capacité des enquêteurs pour enregistrer et quantifier les signaux^{2 +} Ca subcellulaires restreintes dans le temps ou dans l’espace. Ainsi, il a été difficile à capturer, analyser et apprécier la complexité spatiale et temporelle des signaux Ca^{2 +} , ce qui peut être important dans la génération de réponses biologiques souhaités, comme indiqué ci-dessus. Analyse des signaux de Ca^{2 +} des cellules in situs s’appuie généralement sur les mesures d’intensité simple de certaines régions d’intérêt (ROI) dans un champ de vision (FOV). Le choix arbitraire du nombre, taille et position des ROIs, dépendants de la fantaisie du chercheur, peut sérieusement biaiser les résultats obtenus. Ainsi que de la distorsion inhérente à l’analyse du retour sur investissement, cette approche ignore une grande partie des importantes informations contenues dans le champ de vision, comme Ca^{2 +} événements dynamiques dans un arbitrairement choisi de signalisation ROI sont sélectionnés pour l’analyse. En outre, analyse des ROIs ne parvient pas à fournir des informations sur les caractéristiques spatiales des Ca^{2 +} signaux observés. Par exemple, il ne serait pas possible d’établir une distinction entre une augmentation de Ca^{2 +} résultant d’une multiplication Ca^{2 +} wave et un très localisée Ca^{2 +} sortie événement de totalisations des signaux de Ca^{2 +} au sein d’un retour sur investissement.

L’avènement de codé génétiquement Ca^{2 +} indicateurs (GECIs) a radicalement changé comment Ca^{2 +} imagerie peut être effectué sur place^{29,30,31,32,33} . Il y a plusieurs avantages à utiliser GECIs sur teintures. Le plus important peut-être est que l’expression de GECI peut être effectuée d’une manière spécifique de cellule, ce qui réduit la contamination de fond indésirables des cellules pas d’intérêt. Un autre avantage de GECIs Ca^{2 +} indicateurs traditionnels est que Photoblanchiment est réduit (comme la fluorescence et par conséquent le Photoblanchiment se produit uniquement quand les cellules sont actifs), par rapport aux échantillons chargés en colorant, particulièrement à haute grossissement et des taux élevés d’image capturent³⁴. Ainsi, imagerie avec GECIs, tels que la série de GCaMP d’optogenetic capteurs, offre chercheurs la possibilité d’enregistrer brève, localisée subcellulaires Ca^{2 +} signaux in situ et étudier Ca^{2 +} signalisation dans les cellules au sein de leur environnements natifs qui n’ont pas été possibles auparavant. Pour maximiser la récupération d’informations provenant de ces enregistrements de haute résolution, analyse spatiale et temporelle appropriée des Ca^{2 +} signaux est nécessaire. Il convient de noter que tandis que GECIs peut offrir que certains avantages évidents, des études récentes ont révélé que Ca^{2 +} imagerie peut être effectuée avec succès de grandes populations de différentes classes neurochimiques des neurones simultanément à l’aide de classiques Ca^{2 +} indicateurs qui ne sont pas codés génétiquement dans l’ animal³⁵. Cette approche immunohistochimie post-hoc permettant de révéler plusieurs différentes classes de neurones tir à haute fréquence en rafales synchronisés et évite la possibilité que des modifications génétiques de l’animal peuvent avoir nui à la physiologique comportement de l’enquêteur cherche à comprendre les^35,36.

Les protocoles décrits dans le présent document facilitent l’analyse plus complète et quantification de Ca^{2 +} des signaux enregistrés à partir de cellules in situs en utilisant une combinaison de carte spatio-temporelle (STM)-fonction analyse et analyse axée sur les particules. Les protocoles décrivent également comment les différents modèles de Ca^{2 +} signalisation observés dans différentes cellules in situ des populations peuvent être analysées de façon appropriée. À titre d’exemple, la méthode examinera Ca^{2 +} signalisation dans une population spécialisée des cellules dans l’intestin, cellules interstitielles de Cajal (CIC). ICC sont des cellules spécialisées dans le système gastro-intestinal (GI) qui présentent dynamique intracellulaire Ca^{2 +} signalisation, tel qu’il est visualisé à l’aide de souris exprimant GCaMPs^{37,38,39,40, 41,42}. Transitoires de ca^{2 +} en ICC sont liés à l’activation de Ca^{2 +}-activé Cl^– canaux (codées par Ano1) qui sont importants dans la régulation de l’excitabilité du muscle lisse intestinal cellules (CML)^{43, 44,45}. Ainsi, l’étude de Ca^{2 +} signalisation dans ICC est fondamentale pour comprendre la motilité intestinale. L’intestin grêle murine offre un excellent exemple pour cette démonstration, qu’il sont a deux classes de CPI qui sont anatomiquement séparés et peuvent être visualisées indépendamment : J’ai) ICC sont situés dans la zone située entre les muscles lisses circulaires et longitudinaux couches, entourant le plexus myentérique (ICC-MY). Ces cellules servent de cellules de stimulateur cardiaque et génèrent de l’activité électrique appelée ondes lentes^46,47,48,49; II) ICC se trouvent également parmi un plexus riche dans les terminaisons des neurones moteurs (plexus musculaire profond, donc ICC-DMP). Ces cellules servent de médiateurs des réactions à la neurotransmission entérique moteur^37,39,40,50. MY-ICC et ICC-DMP sont morphologiquement différentes, et leurs Ca^{2 +} signalisation comportements diffèrent radicalement pour accomplir leurs tâches spécifiques. ICC-MY sont stellaire en forme et forment un réseau de cellules interconnectées via gap jonctions,^51,52. Ca^{2 +} des signaux dans le manifeste de l’ICC-MY brèves et localisées dans l’espace Ca^{2 +} sortie des événements se produisant à plusieurs sites de façon asynchrone par le biais de l’ICC-mon réseau comme visualisées dans un champ de vision (photographié avec un objectif X 60)³⁸. Ces signaux asynchrones est organisés dans le temps en 1 seconde de clusters qui, lorsque totalisées ensemble, s’élèvent à une net 1 s cellulaire augmentation de Ca^{2 +}. Ces signaux propage de cellule-cellule au sein du réseau ICC et donc organise Ca^{2 +} signalisation, générés à partir des sites subcellulaires, sous une tissu large Ca^{2 +} vague. Temporelle de clustering et de sommation de Ca^{2 +} signaux dans ICC-MY a appelé Ca^{2 +} grappes transitoire (CTC)³⁸. CTC se produire rythmiquement (durées par exemple assez semblables et des périodes similaires entre CTC) 30 périodes par minute chez la souris. À l’inverse, ICC-DMP sont les cellules fusiforme, certains avec des processus secondaires, qui distribuent entre les CML et les axones variqueux et ne sont pas indépendamment forment un réseau^51,52. Toutefois, ICC-DMP forment les jonctions avec la CML et fonction au sein de ce grand syncytium, connu comme le SIP syncytium⁵³. Signaux de ca^{2 +} se produisent à plusieurs endroits le long de la longueur des cellules, mais ces transitoires ne sont pas entraînés ou groupées dans le temps, tel qu’observé dans ICC-MY³⁷. Ca^{2 +} signaux dans ICC-DMP se produisent de manière stochastique, avec des intensités variables, des durées et des caractéristiques spatiales. Les protocoles ci-dessous, en utilisant l’exemple de Ca^{2 +} signalisation dans MY-ICC et ICC-DMP, décrivent des techniques pour analyser la signalisation complexes dans les types spécifiques de cellules in situs. Nous avons utilisé le système de p de Cre-Lox inductible pour exprimer GCaMP6f exclusivement à la CPI, après induisant l’activation de Cre-Recombinase (Cre), conduite par un promoteur spécifique de l’ICC (Kit).

Protocol

Tous les animaux utilisés et les protocoles réalisées dans cette étude étaient conformes au Guide National des instituts de santé pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les procédures ont été approuvées par l’Institutional Animal Use et le Comité de protection de l’Université du Nevada, Reno. 1. génération de souris KitGCaMP6f Croix de Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f, souris) et c-Kit+ / Cre ERT2 (Kit-Cre souris) pour générer d…

Representative Results

À l’aide de Kit-Cre-GCaMP6F souris (Figure 1), dynamique Ca2 + signalisation comportements d’ICC dans le tractus gastro-intestinal peuvent être photographiées sur place. Avec la microscopie confocale, photos haute résolution de certaines populations de CPI peuvent être acquis sans contaminer les signaux des autres populations d’ICC dans le même tissu mais en avions anatomiquement distinctes de mise au point (Figure …

Discussion

Ca^{2 +} imagerie des types spécifiques de cellules dans les tissus intacts ou au sein des réseaux de cellules souvent révèle des motifs complexes de transitoires de Ca^{2 +} . Cette activité nécessite une analyse attentive et approfondie et quantification de capturer plus d’informations sur les événements sous-jacents et la cinétique de ces événements que possible. STM et analyse PTCL fournissent une occasion de maximiser la quantité de données quantitatives dans les enregistrements de ce …

Materials

Image J software	NIH	1.5a	Image J software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6