Beheer van de clusters van de eerste 3D-cel in een hybride Gel kubus apparaat voor herhaalbare patroon formaties
Summary
Presenteren we een procedure voor de controle op de eerste cel cluster-vorm in een 3D extracellulaire matrix te verkrijgen van een herhaalbare patroonformatie. Een kubieke apparaat met twee verschillende hydrogels wordt gebruikt om verschillende richtingen imaging voor weefsel patroonformatie.
Abstract
Het belang van in vitro culturen van 3D is aanzienlijk benadrukt in cel/weefselkweek. Echter behoort het gebrek aan experimentele herhaalbaarheid tot haar beperkingen. De analyse van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de zelf-organisatie verslechtert produceren weinig herhaalbare resultaten van patroonformatie. Vermindering van de variatie in de voorwaarden van de oorspronkelijke cultuur, zoals de celdichtheid en distributie in de extracellulaire matrix (ECM), is cruciaal voor het verbeteren van de herhaalbaarheid van een 3D-cultuur. In dit artikel tonen we een eenvoudige, maar robuuste procedure voor de controle op de eerste cel cluster-vorm in een 3D extracellulaire matrix te verkrijgen zeer herhaalbare patroon formaties. Een micromold met een gewenste vorm werd vervaardigd met behulp van fotolithografie of een machinale bewerking proces, en het een 3D zak gevormd in de ECM vervat in een hybride gel kubus (HGC). Sterk geconcentreerde cellen werden vervolgens geïnjecteerd in de zak zodat de cel cluster vorm gekoppeld aan de shape verzonnen schimmel. De werknemer HGC toegestaan verschillende richtingen scannen door de rotatie, waardoor hoge resolutie beeldvorming en de verovering van de hele weefsel structuur ook al een laag-vergroting lens werd gebruikt. Normale menselijke bronchiale epitheliale cellen werden gebruikt om aan te tonen van de methodologie.
Introduction
Het belang van een 3D-cultuur, die beter biologische omgevingen bootst dan een 2D cultuur doet, is aanzienlijk benadrukt in cel/weefsel cultuur1,2,3. De interactie tussen de cellen en de extracellulaire matrix (ECM) biedt belangrijke signalen met betrekking tot voedselproductie4,5. Veel weefsel formaties kunnen komen alleen onder 3D omgevingen, zoals vouwen proces6,7, invagination8en tubulaire vorming9,10. Echter talrijke moeilijkheden te voorkomen dat onderzoekers verschuiven naar 3D experimenten uit 2D experimenten op een schotel. Een van de grootste problemen in 3D experimenten is de kwestie van imaging 3D monsters. Vergeleken met vlakke experimenten, is verwerving van passende 3D-beelden nog uitdagend in veel gevallen. In het bijzonder, is het verkrijgen van een passende 3D beeld een moeilijke taak, wanneer de grootte van de steekproef het bereik van de millimeter als gevolg van de grote focale diepte van lage-vergroting lenzen bereikt. Bijvoorbeeld, bereikt de focal diepte meer dan 50 µm wanneer een 10 x vergroting lens wordt gebruikt terwijl de grootte van een enkele cel gewoonlijk minder dan 10 µm is. Ter verhoging van de kwaliteit van de beeldvorming, hoogtechnologische microscopie systemen worden ontwikkeld (bijvoorbeeld twee-foton microscopie11 en licht vel microscopie systeem12), maar de beschikbaarheid ervan is beperkt vanwege hun dure prijs. Als alternatief hebben we eerder een hybride gel kubus (HGC) apparaat13ontwikkeld. Het apparaat bestaat uit twee soorten hydrogels: agarose als een ondersteuning-gel en een ECM zoals collageen of Matrigel als een cultuur-gel. Het HGC laat ons toe om het monster te verzamelen tijdens het kweken en draai de kubus om verschillende richtingen imaging, dat zich richt op de focal diepte probleem14.
Een ander probleem in 3D experimenten is hun lage herhaalbaarheid vanwege de slechte controleerbaarheid van de 3D omgevingen. In tegenstelling tot een vlakke cultuur op een kunststof schotel optreden variaties in de voorwaarden van de oorspronkelijke cultuur gemakkelijk in een 3D-ruimte omgeven door een zacht materiaal. Een aanzienlijke variatie in de experimentele resultaten verslechtert de volgende analyse en maskeert de onderliggende mechanismen. Vele engineering technologieën zijn ontwikkeld om het ruimtelijk uitlijnen afzonderlijke cellen, zoals de bioprinting15,16, vezel weven17, en steigers18, maar zij vereisen complexe voorbewerken of in het bijzonder ontworpen apparatuur. Wij hebben daarentegen een methodologie voor het bereiken van 3D Celuitlijning in een HGC19ontwikkeld.
In dit protocol geïllustreerd we een eenvoudige procedure met veel gebruikte apparatuur voor het beheersen van de 3D eerste cel cluster-vorm in een HGC. Ten eerste werd het fabricageproces van het HGC aangetoond. Vervolgens werden in de HGC voor de productie van een zakje met een willekeurige vorm in een ECM micromolds vervaardigd door fotolithografie of een machinale bewerking proces geplaatst. Zeer dichte cellen na het centrifugeren werden vervolgens geïnjecteerd in de zak om de eerste cel cluster vorm in de HGC te bepalen. Het cluster precies gecontroleerde cel kon worden beeld uit de vele richtingen vanwege de HGC. Normale cellen voor menselijke epitheliale bronchiale (NHBE) werden gebruikt om aan te tonen van de controle op de eerste cel cluster vorm en beeldvorming van de takken vanuit meerdere richtingen voor het verbeteren van de kwaliteit van de beeldvorming.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methode die in dit document gepresenteerd is eenvoudig en kan worden uitgevoerd zonder hoogtechnologische apparatuur. Gelijktijdig, kan een precieze cel cluster vorm controleresultaat in de 3D-ruimte hydrogel worden verkregen. Na de eerste controle, kunnen de cellen groeien in de HGC zo veel als ze gekweekt op een schotel zijn. De verschillende richtingen beeldvorming wordt uitgevoerd door het draaien van het monster met de HGC met behulp van een systeem van microscopie, en het verbetert aanzienlijk de kwaliteit van d…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd financieel ondersteund door JSPS KAKENHI (18H 04765) en het programma te verspreiden Tenure Track systeem, MEXT, Japan.
Materials
| 12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
| 2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
| 4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
| Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| AZ1512 | Merck | ||
| BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
| Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
| Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
| Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
| Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
| SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
| SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
| Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
Referencias
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -. F. Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).
- Tawk, M., et al. A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis. Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).
- Zegers, M. M. P., O’Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).
- Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Huisken, J., et al. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. , 1007-1009 (2004).
- Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations. Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device. Applied Sciences. 8 (235), (2018).
- Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Onoe, H., et al. Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions. Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations. Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
