Controllo del Cluster iniziale delle cellule 3D in un ibrido Gel cubo dispositivo per reticolo ripetibile formazioni
Summary
Presentiamo una procedura per controllare la forma di cluster iniziale delle cellule in una matrice extracellulare 3D per ottenere una formazione di reticolo ripetibile. Un dispositivo cubico contenente due diversi idrogeli è impiegato per realizzare multi-direzionale imaging per la formazione del reticolo di tessuto.
Abstract
L’importanza delle colture in vitro di 3D notevolmente è sottolineata nella coltura del tessuto e delle cellule. Tuttavia, la mancanza di ripetibilità sperimentale è una delle sue restrizioni. Producendo pochi risultati ripetibili di formazione di pattern si deteriora l’analisi dei meccanismi di auto-organizzazione. Ridurre la variazione in condizioni di coltura iniziale, come ad esempio la densità delle cellule e la distribuzione nella matrice extracellulare (ECM), è fondamentale per migliorare la ripetibilità di una cultura 3D. In questo articolo, dimostriamo una procedura semplice ma robusta per controllare la forma di cluster iniziale delle cellule in una matrice extracellulare 3D per ottenere formazioni reticolo altamente ripetibile. Un micromold con una forma desiderata è stato fabbricato utilizzando fotolitografia o un processo di lavorazione, e formava una tasca 3D in ECM contenuta in un cubo di gel ibrido (HGC). Le cellule altamente concentrate quindi sono state iniettate nella tasca affinché la forma di cluster di cellule abbinato con la forma di stampo fabbricato. Il lavoratore HGC ammessi multi-direzionale scansione dalla sua rotazione, che permetteva a imaging ad alta risoluzione e la cattura di struttura del tessuto intero anche se è stato utilizzato un basso ingrandimento lente. Cellule epiteliali bronchiali umane normali sono state usate per illustrare la metodologia.
Introduction
Notevolmente è sottolineata l’importanza di una cultura 3D, che imita meglio ambienti biologici rispetto a una cultura 2D, in cellule/tessuti cultura1,2,3. L’interazione tra cellule e matrice extracellulare (ECM) fornisce importanti indicazioni riguardanti la morfogenesi4,5. Molti tessuti formazioni possono emergere solo in ambienti 3D, quali la piegatura processo6,7, invaginazione8e formazione tubolare9,10. Tuttavia, numerose difficoltà impediscono i ricercatori di spostamento agli esperimenti 3D da esperimenti 2D su un piatto. Una delle difficoltà principali in esperimenti di 3D è la questione dei campioni 3D imaging. Confrontati con gli esperimenti planari, acquisizione di immagini 3D appropriate è ancora difficile in molti casi. In particolare, ottenendo un’immagine 3D appropriata è un compito difficile quando la dimensione del campione raggiunge l’intervallo di millimetro a causa della grande profondità focale di lenti a basso ingrandimento. Ad esempio, la profondità focale raggiunge più di 50 µm quando una lente di ingrandimento di 10x è usato mentre la dimensione della cella singola è normalmente inferiore a 10 µm. Per migliorare la qualità delle immagini, sistemi di microscopia ad alta tecnologia sono in fase di sviluppo (per esempio, microscopia del due-fotone11 e microscopia luce-foglio sistema12), ma la loro disponibilità è limitata a causa del loro prezzo costoso. In alternativa, in precedenza abbiamo sviluppato un ibrido gel cubo (HGC) dispositivo13. Il dispositivo è costituito da due tipi di idrogeli: agarosio come un gel di supporto e un ECM come il collagene o Matrigel come un gel di cultura. La HGC permette di raccogliere il campione durante la messa in coltura e ruotare il cubo per ottenere immagini multi-direzionale, che affronta il problema di profondità focale14.
Un’altra difficoltà in esperimenti di 3D è loro ripetibilità bassa a causa della scarsa controllabilità degli ambienti 3D. A differenza di una coltura planare su un piatto di plastica, variazioni delle condizioni di coltura iniziale si verificano facilmente in uno spazio 3D, circondato da un materiale morbido. Una variazione significativa nei risultati sperimentali si deteriora la seguente analisi e maschera i meccanismi di fondo. Molte tecnologie di ingegneria sono stati sviluppati per allineare spazialmente cellule singole, ad esempio multimateriali15,16, fibra tessitura17e ponteggi18, ma richiedono pre-elaborazione complessa o specificamente apparecchiature progettate. Al contrario, abbiamo sviluppato una metodologia per realizzare l’allineamento di cella 3D in un HGC19.
In questo protocollo, abbiamo illustrato una procedura semplice con attrezzature comunemente usate per controllare la forma di cluster iniziale 3D delle cellule in un HGC. In primo luogo, il processo di fabbricazione dell’HGC è stato dimostrato. Quindi, micromolds fabbricato di fotolitografia o un processo di lavorazione sono stati collocati in HGC per produrre una tasca con una forma arbitraria a un ECM. Successivamente, cellule altamente dense dopo centrifugazione sono state iniettate nella tasca per controllare la forma di cluster iniziale delle cellule nel HGC. Il cluster precisamente controllata delle cellule potrebbe essere imaged da molte direzioni a causa della HGC. Cellule (NHBE) di epiteliali bronchiali umane normali sono state usate per dimostrare il controllo della forma di cluster iniziale delle cellule e la formazione immagine dei rami da più direzioni per migliorare la qualità delle immagini.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo presentato in questa carta è semplice e può essere eseguito senza attrezzature ad alta tecnologia. Contemporaneamente, un risultato di controllo cella precisa forma cluster nello spazio 3D di idrogel è ottenibile. Dopo il controllo iniziale, le cellule possono crescere nel HGC tanto quanto sono coltivate su un piatto. L’imaging multi-direzionale viene eseguita ruotando il campione con l’HGC utilizzando qualsiasi sistema di microscopia, e migliora significativamente la qualità delle immagini. La scelta dei m…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata sostenuta finanziariamente dalla JSPS KAKENHI (18h 04765) e il programma per diffondere Tenure Track System, MEXT, Giappone.
Materials
| 12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
| 2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
| 4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
| Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| AZ1512 | Merck | ||
| BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
| Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
| Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
| Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
| Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
| SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
| SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
| Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
Referencias
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