Contrôle de Cluster cellule 3D initial dans un dispositif hybride Gel Cube modèle répétable Formations

Summary

Nous présentons une procédure pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale dans une matrice extracellulaire 3D pour obtenir une formation de modèles reproductibles. Un dispositif cube contenant deux hydrogels différentes est utilisé pour atteindre multidirectionnel d’imagerie pour la formation de tissu motif.

Abstract

L’importance des cultures in vitro de 3D est nettement soulignée dans la culture de cellules/tissus. Toutefois, l’absence de répétabilité expérimentale est l’un des ses restrictions. Quelques résultats reproductibles de la formation détériore l’analyse les mécanismes sous-jacents à l’auto-organisation. Réduire la variation dans des conditions de culture initiale, comme la densité cellulaire et la distribution de la matrice extracellulaire (ECM), est cruciale pour améliorer la répétabilité d’une culture 3D. Dans cet article, nous démontrons une procédure simple mais robuste pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale dans une matrice extracellulaire 3D pour obtenir des formations modèle hautement reproductible. Un micromold avec une forme désirée a été fabriqué à l’aide de la photolithographie ou un processus d’usinage, et il forma une poche 3D dans l’ECM contenue dans un cube de gel hybride (HGC). Très concentrée de cellules ont été ensuite injectés dans la poche pour que la forme des cellules cluster mis en correspondance avec la forme du moule fabriqué. Le HGC indépendant autorisés multidirectionnel le balayage par sa rotation, qui a permis d’imagerie à haute résolution et la capture de la structure du tissu entier même si une lentille de grossissement faible a été utilisée. Les cellules épithéliales bronchiques humaines normales ont été utilisés pour démontrer la méthodologie.

Introduction

L’importance d’une culture 3D, qui mieux imite des milieux biologiques que ne le fait une culture 2D, est nettement soulignée dans la culture de cellules/tissus^1,2,3. L’interaction entre les cellules et la matrice extracellulaire (ECM) fournit des indices importants au sujet de la morphogenèse^4,5. Nombreuses formations tissulaires peuvent apparaître uniquement dans des environnements 3D, comme le pliage processus^6,7, invagination⁸et formation tubulaire^9,10. Toutefois, nombreuses difficultés empêchent les chercheurs de se déplacer à des expériences 3D d’expériences 2D sur un plat. Une des difficultés majeures dans les expériences 3D est celui de l’imagerie 3D échantillons. Par rapport aux expériences planaires, acquisition d’images 3D appropriés est toujours difficile dans de nombreux cas. En particulier, l’obtention d’une image 3D appropriée est une tâche difficile lorsque la taille de l’échantillon atteint la plage de millimètre en raison de la grande profondeur focale des lentilles de grossissement faible. Par exemple, la profondeur focale atteint plus de 50 µm lorsqu’un 10 x grossissement objectif est utilisé alors que la taille de la cellule unique est normalement inférieur à 10 µm. Afin d’améliorer la qualité d’imagerie, systèmes de microscopie de haute technologie sont développées (p. ex., microscopie biphotonique¹¹ et système de microscopie de lumière-fiche¹²), mais leur disponibilité est limitée en raison de leur prix élevé. Comme alternative, nous avons déjà développé un hybride gel cube (HGC) dispositif¹³. Le dispositif se compose de deux types d’hydrogels : gel d’agarose comme un gel de l’aide et un ECM comme le collagène ou Matrigel comme un gel de la culture. Le HGC permet de recueillir les échantillons au cours de la mise en culture et faire pivoter le cube pour atteindre l’imagerie multidirectionnel, qui aborde le problème de profondeur focale¹⁴.

Une autre difficulté dans des expériences 3D est leur faible répétabilité en raison de la piètre contrôlabilité des environnements 3D. Contrairement à une culture plane sur un plat en plastique, des variations dans les conditions de culture initiale se produisent facilement dans un espace 3D, entouré d’un matériau doux. Une variation significative dans les résultats expérimentaux détériore l’analyse qui suit et qui masque les mécanismes sous-jacents. Ingénierie de nombreuses technologies ont été développées pour aligner dans l’espace des cellules individuelles, par exemple bioprinting^15,16,¹⁷et¹⁸d’échafaudage, de tissage de fibres, mais elles nécessitent un prétraitement complexes ou spécifiquement matériel conçu. En revanche, nous avons développé une méthodologie pour réaliser l’alignement de cellule 3D dans un HGC¹⁹.

Dans ce protocole, nous montre une procédure simple avec équipement couramment utilisé pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale 3D dans un HGC. Tout d’abord, le processus de fabrication de la HGC a été démontré. Puis, micromolds fabriquées par photolithographie ou un processus d’usinage ont été placés dans la HGC pour produire une poche avec une forme arbitraire dans un ECM. Par la suite, des cellules très denses après centrifugation ont été injectées dans la poche pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale dans la HGC. L’amas de cellule contrôlée avec précision pourrait être photographié de nombreuses directions en raison de la HGC. Normal humain (NHBE) les cellules épithéliales bronchiques ont été utilisées pour démontrer le contrôle de la forme de grappe de cellule initiale et l’imagerie des branches dans des directions multiples, pour améliorer la qualité d’imagerie.

Protocol

1. fabrication de dispositif de cube pour le gel hybride Préparer un cadre de cubes en polycarbonate (PC) à l’aide d’un procédé d’usinage ou une imprimante 3D. La taille de la trame de la PC dépend de la taille de l’échantillon. Dans cette étude, nous avons utilisé un cadre de 5 mm de chaque côté afin que les branches avaient suffisamment d’espace pour s’allonger au cours de la mise en culture. Poser le cadre de la PC sur une lame de verre préalablement refroidi ou une autre sur…

Representative Results

Normal humain (NHBE) les cellules épithéliales bronchiques ont été utilisés pour démontrer la méthode illustrée et contrôler la géométrie de la cellule collective initiale pour obtenir la forme d’un cylindre et une forme de prisme, respectivement dans un environnement ECM. Les résultats d’imagerie multidirectionnels obtenus par contraste de phase comme phalloïdine coloration d’une forme de cylindre (Figure 4 aB) et la forme…

Discussion

La méthode présentée dans cet article est simple et peut s’effectuer sans le matériel de haute technologie. Parallèlement, un résultat de contrôle précis cell cluster forme dans l’espace 3D d’hydrogel peut être obtenu. Après le contrôle initial, les cellules peuvent croître dans la HGC autant qu’ils sont cultivés sur un plat. L’imagerie multidirectionnelle s’effectue en faisant tourner l’échantillon avec la HGC en utilisant n’importe quel système de microscopie, et il améliore considérabl…

Materials

12-well-plate	Corning  Inc.	3513
2-Methoxy-1-methylethyl Acetate	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	130-10505	PGMEA, CAS: 108-65-6
4% paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	161-20141	CAS: 30525-89-4
Agarose, low gelling temperature  BioReagent	Sigma-Aldrich	A9414
Alexa fluor 488 phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
AZ1512	Merck
BEGM bullet kit	Lonza	CC-3170	Specialized medium for NHBE cells
Bovine Serum Albumin solution (10 %)	Sigma-Aldrich	A1595
EGM-2 bullet kit	Lonza	CC-3162	Specialized medium for endothelial cells
Lipidure	NOF co.		MPC polymer
Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix	Corning  Inc.	354230
Normal Goat Serum (10%)	Thermo Fisher Scientific	50197Z
Normal human bronchial epithelial cells	Lonza	CC-2541
SILPOT 184 W/C	Dow Corning Co.	3255981	Base resin and catalyst for PDMS
SUEX D300		DJ MicroLaminates, Inc	Thick negative photoresist (thichness: 300 mm)
Triton X-100 (1%)	Thermo Fisher Scientific	HFH10
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	25200056
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416