Celular 3D inicial grupo Control en un dispositivo híbrido Gel cubo para formaciones de patrón repetible
Summary
Presentamos un procedimiento para el control de la forma de racimo de célula inicial en una matriz extracelular 3D para obtener una formación de patrón repetible. Un dispositivo cúbico que contiene dos diferentes hidrogeles se emplea para lograr la proyección de imagen multi-direccional para la formación de patrones de tejido.
Abstract
La importancia de cultivos in vitro de 3D se acentúa considerablemente en cultura de célula y tejidos. Sin embargo, la falta de repetibilidad experimental es una de las restricciones. Produciendo pocos resultados repetibles de formación, deteriora el análisis de los mecanismos subyacentes a la propia organización. Reducción de la variación en las condiciones de cultivo inicial, como la densidad de la célula y la distribución en la matriz extracelular (ECM), es crucial para mejorar la repetibilidad de una cultura 3D. En este artículo, se demuestra un procedimiento sencillo pero robusto para el control de la forma de racimo de célula inicial en una matriz extracelular 3D para obtener las formaciones patrón altamente repetible. Micromold con forma deseada fue fabricado utilizando Fotolitografía o un proceso de mecanizado, y formó un bolsillo 3D en el ECM contenido en un cubo de gel híbrido (HGC). Células altamente concentradas entonces se inyectaron en el bolsillo de manera que la forma de racimo de células con la forma del molde fabricado. La HGC empleada permitió multidireccional de su rotación, lo que permitió la proyección de imagen de alta resolución y la captura de la estructura de tejido entero aunque se utilizó una lente de baja magnificación. Células epiteliales bronquiales humanas normales fueron utilizadas para demostrar la metodología.
Introduction
La importancia de una cultura 3D, que mejor simula entornos biológicos que hace una cultura 2D, se acentúa considerablemente en el tejido de la célula cultura1,2,3. La interacción entre las células y matriz extracelular (ECM) proporciona pistas importantes sobre morfogénesis4,5. Muchas formaciones de tejido pueden surgir sólo en entornos 3D, como el plegamiento proceso6,7, invaginación8formación tubular9,10. Sin embargo, numerosas dificultades que los investigadores pasando a 3D experimentos de experimentos 2D en un plato. Una de las mayores dificultades en experimentos 3D es el tema de la proyección de imagen 3D muestras. Comparado con experimentos planares, adquisición de imágenes 3D adecuados es aún un desafío en muchos casos. En particular, obtener una imagen 3D adecuada es una tarea difícil cuando el tamaño de la muestra alcanza el rango de milímetros debido a la gran profundidad focal de lentes de bajo aumento. Por ejemplo, la profundidad focal alcanza más de 50 μm cuando 10 x lente de aumento se utiliza mientras que el tamaño de la célula es normalmente menos de 10 μm. Para mejorar la calidad de imagen, se están desarrollando sistemas de microscopía de alta tecnología (por ejemplo, microscopía de dos fotones11 y microscopía de luz hoja sistema12), pero su disponibilidad es limitada debido a su costoso precio. Como alternativa, previamente hemos desarrollado un híbrido gel cubo (HGC) dispositivo13. El dispositivo consta de dos tipos de hidrogeles: agarosa como un gel de soporte y un ECM como colágeno o Matrigel como un gel de cultura. La HGC nos permite recoger la muestra durante el cultivo y girar el cubo para lograr la proyección de imagen multi-direccional, que aborda el problema de profundidad focal14.
Otra dificultad en experimentos 3D es su repetibilidad baja debido a la pobre controlabilidad de los entornos 3D. A diferencia de una cultura planar en un plato de plástico, las variaciones en las condiciones de cultivo inicial se producen fácilmente en un espacio 3D rodeado por un material suave. Una variación significativa en los resultados experimentales deteriora el siguiente análisis y enmascara los mecanismos subyacentes. Se han desarrollado muchas tecnologías de ingeniería espacial alinear celdas individuales, tales como bioprinting15,16, fibra tejido17y18de andamios, pero requieren de procesamiento complejo o específicamente equipo de diseño. En cambio, hemos desarrollado una metodología para lograr un alineamiento celular 3D en una HGC19.
En este protocolo, ilustra un procedimiento simple con equipos utilizados para el control de la forma de racimo 3D de la célula inicial en un HGC. En primer lugar, se demostró el proceso de fabricación de la HGC. Micromolds fabricados por Fotolitografía o un proceso de mecanizado se colocan en la HGC para producir un bolsillo con una forma arbitraria en una ECM. Posteriormente, fueron inyectadas células altamente densas después de la centrifugación en el bolsillo para controlar la forma de racimo de células iniciales en el HGC. El cúmulo celular precisamente controlada podría ser reflejado desde todas las direcciones debido a la HGC. Células epiteliales bronquiales humanas normales (NHBE) fueron utilizadas para demostrar el control de la forma de racimo de células inicial y la proyección de imagen de las ramas de direcciones múltiples para mejorar la calidad de imagen.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método presentado en este trabajo es simple y puede realizarse sin equipos de alta tecnología. Al mismo tiempo, puede obtenerse un resultado del control preciso de la célula cluster forma en el espacio 3D de hidrogel. Después del control inicial, las células pueden crecer en el HGC, tanto como se cultivan en un plato. La proyección de imagen multi-direccional se realiza girando la muestra con la HGC utilizando cualquier sistema de microscopía, y mejora significativamente la calidad de imagen. La elección de lo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por KAKENHI JSPS (18H 04765) y el programa para difundir vía sistema, MEXT, Japón.
Materials
| 12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
| 2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
| 4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
| Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| AZ1512 | Merck | ||
| BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
| Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
| Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
| Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
| Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
| SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
| SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
| Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
Referencias
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