שליטה אשכול הראשונית תא 3D היברידית ג'ל קוביה התקן עבור תצורות דפוס הדיר
Summary
אנו מציגים הליך לשליטה אשכול תא ראשוני הצורה מטריצה חוץ-תאית תלת-ממד כדי לקבל צורה דפוס הדיר. מכשיר מעוקב המכיל שני hydrogels שונים הוא מועסק כדי להשיג הדמיה רב כיוונית עבור צורה דפוס רקמות.
Abstract
החשיבות של תרבויות 3D במבחנה מודגשת במידה ניכרת בתרבות תא/רקמות. עם זאת, חוסר ניסיוני הדיר הוא אחד את ההגבלות שהיא מטילה. הפקת תוצאות הדיר כמה תבניות מתדרדר הניתוח של המנגנונים הארגון עצמית. הפחתת וריאציה של תנאי התרבות הראשונית צפיפות התאים והפצה מטריצה חוץ-תאית (ECM), חיוני לשפר את הדיר של תרבות תלת-ממד. במאמר זה נדגים הליך פשוט אך חזקים לשליטה הצורה אשכול תא הראשונית מטריצה חוץ-תאית תלת-ממד כדי לקבל תבנית מאוד הדיר תצורות. Micromold לצורה הרצויה היה מפוברק על-ידי שימוש פוטוליתוגרפיה או תהליך עיבוד שבבי, הוא נוצר כיס תלת-ממד ב- ECM הכלול קוביה ג’ל היברידית (HGC). תאים מרוכז ואז הוזרקו בכיס כך הצורה אשכול תא מתאימים עם הצורה עובש מפוברק. HGC מועסקים מותר רב כיוונית סריקה על ידי הסיבוב שלה, שאיפשר דימות ברזולוציה גבוהה ועל לכידתו של המבנה כולו רקמות למרות עדשת הגדלה נמוכה שימש. אדם נורמלי הכיל. תאים אפיתליים הסמפונות שימשו כדי להדגים את המתודולוגיה.
Introduction
חשיבותה של תרבות 3D, אשר כדאי מחקה סביבות ביולוגי מאשר תרבות 2D, מודגשת במידה ניכרת תא/רקמות תרבות1,2,3. האינטראקציה בין תאים מטריצה חוץ-תאית (ECM) מספק רמזים חשובים לגבי מורפוגנזה4,5. תצורות רקמות רבים יכולים לצאת רק תחת סביבות תלת-ממד, כגון תהליך קיפול6,7, invagination8ו מבנה צינורי9,10. עם זאת, הקשיים למנוע חוקרים הסטה ל ניסויים תלת-ממד של ניסויים 2D בצלחת. אחד הקשיים העיקריים בניסויים 3D הוא הנושא של דגימות 3D הדמיה. לעומת ניסויים מישורי, רכישת תמונות תלת-ממד המתאים הוא עדיין מאתגר במקרים רבים. בפרט, קבלת תמונה תלת-ממדית המתאימה היא משימה קשה כאשר גודל המדגם מגיע הטווח מ מ בשל העומק מוקד גדול של עדשות ההגדלה נמוך. לדוגמה, עומק מוקד מגיע יותר מ 50 מיקרומטר כאשר 10 x עדשת הגדלה בזמן הגודל של התא הבודד הוא בדרך כלל פחות מ- 10 מיקרומטר. כדי לשפר את איכות הדמיה, מפתחים מערכות טכנולוגיה מיקרוסקופ (למשל מיקרוסקופ שני הפוטונים11 ו מערכת מיקרוסקופ אור-גיליון12), אבל את זמינותם מוגבל בשל מחירן יקר. כחלופה, פותחו בעבר היברידית ג’ל קוביה (HGC) התקן13. המכשיר מורכב משני סוגים של hydrogels: agarose ג’ל תמיכה, ECM כמו קולגן או Matrigel כמו ג’ל תרבות. HGC מאפשר לנו לאסוף את הדגימה במהלך culturing לסובב את הקוביה כדי להשיג הדמיה רב כיוונית, אשר פותר את הבעיה של מוקד עומק14.
קושי נוסף בניסויים 3D הוא שלהם הדיר נמוכה בשל בקירות וצפיות המסכן סביבות תלת-ממד. בניגוד תרבות מישורי בצלחת פלסטיק, בווריאציות התנאים התרבות הראשונית בקלות להתרחש במרחב תלת-ממדי מוקף בחומר רך. וריאציה משמעותי בתוצאות הניסוי מתדרדר את הניתוח הבא ומסכות המנגנונים המשמשת כבסיס. טכנולוגיות הנדסיות רבות פותחו ליישור במרחב תאים בודדים, כגון15,bioprinting16, סיבים אריגה17, פיגומים18, אבל הם דורשים preprocessing מורכבים או באופן ספציפי ציוד מעוצב. לעומת זאת, פיתחנו מתודולוגיה להשגת תא 3D יישור HGC19.
ב פרוטוקול זה, אנחנו מאויר הליך פשוט עם ציוד נפוץ לשליטה הצורה אשכול 3D תא הראשונית HGC. ראשית, הודגם תהליך ייצור HGC. לאחר מכן, micromolds מפוברק על ידי פוטוליתוגרפיה או תהליך עיבוד שבבי יכניסו את HGC לייצר כיס עם צורה שרירותית ב- ECM. לאחר מכן, הוזרקו תאים בעלי צפיפות גבוהה לאחר צנטריפוגה לתוך הכיס כדי לשלוט בצורה אשכול תא הראשונית ב HGC. האשכול התא מבוקרת בדיוק יכול לדימות מכיוונים רבים בגלל HGC. האדם הסמפונות אפיתל (NHBE) תאים נורמליים שימשו כדי להפגין השליטה של הצורה אשכול תא ראשוני והדמיה של הענפים מכיוונים רבים לשיפור איכות הדמיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המובאת בעיתון הזה הוא פשוט, יכול להתבצע ללא ציוד טכנולוגיה. במקביל, ניתן להשיג תוצאה שליטה צורה של אשכול תא מדויק במרחב תלת-ממדי של הידרוג. לאחר הפקד הראשונית, התאים יכולים לגדול ב- HGC עד כמה הם בתרבית על צלחת. ההדמיה רב כיוונית מתבצע על ידי סיבוב הדגימה עם HGC באמצעות כל מערכת מיקרוסקופ, …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי JSPS KAKENHI (18H 04765) ואת התוכנית להפצת מערכת מעקב אחר הקביעות, MEXT, יפן.
Materials
| 12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
| 2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
| 4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
| Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| AZ1512 | Merck | ||
| BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
| Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
| Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
| Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
| Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
| SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
| SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
| Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
Referencias
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -. F. Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).
- Tawk, M., et al. A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis. Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).
- Zegers, M. M. P., O’Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).
- Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Huisken, J., et al. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. , 1007-1009 (2004).
- Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations. Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device. Applied Sciences. 8 (235), (2018).
- Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Onoe, H., et al. Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions. Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations. Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
