Nous présentons une procédure pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale dans une matrice extracellulaire 3D pour obtenir une formation de modèles reproductibles. Un dispositif cube contenant deux hydrogels différentes est utilisé pour atteindre multidirectionnel d’imagerie pour la formation de tissu motif.
L’importance des cultures in vitro de 3D est nettement soulignée dans la culture de cellules/tissus. Toutefois, l’absence de répétabilité expérimentale est l’un des ses restrictions. Quelques résultats reproductibles de la formation détériore l’analyse les mécanismes sous-jacents à l’auto-organisation. Réduire la variation dans des conditions de culture initiale, comme la densité cellulaire et la distribution de la matrice extracellulaire (ECM), est cruciale pour améliorer la répétabilité d’une culture 3D. Dans cet article, nous démontrons une procédure simple mais robuste pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale dans une matrice extracellulaire 3D pour obtenir des formations modèle hautement reproductible. Un micromold avec une forme désirée a été fabriqué à l’aide de la photolithographie ou un processus d’usinage, et il forma une poche 3D dans l’ECM contenue dans un cube de gel hybride (HGC). Très concentrée de cellules ont été ensuite injectés dans la poche pour que la forme des cellules cluster mis en correspondance avec la forme du moule fabriqué. Le HGC indépendant autorisés multidirectionnel le balayage par sa rotation, qui a permis d’imagerie à haute résolution et la capture de la structure du tissu entier même si une lentille de grossissement faible a été utilisée. Les cellules épithéliales bronchiques humaines normales ont été utilisés pour démontrer la méthodologie.
L’importance d’une culture 3D, qui mieux imite des milieux biologiques que ne le fait une culture 2D, est nettement soulignée dans la culture de cellules/tissus1,2,3. L’interaction entre les cellules et la matrice extracellulaire (ECM) fournit des indices importants au sujet de la morphogenèse4,5. Nombreuses formations tissulaires peuvent apparaître uniquement dans des environnements 3D, comme le pliage processus6,7, invagination8et formation tubulaire9,10. Toutefois, nombreuses difficultés empêchent les chercheurs de se déplacer à des expériences 3D d’expériences 2D sur un plat. Une des difficultés majeures dans les expériences 3D est celui de l’imagerie 3D échantillons. Par rapport aux expériences planaires, acquisition d’images 3D appropriés est toujours difficile dans de nombreux cas. En particulier, l’obtention d’une image 3D appropriée est une tâche difficile lorsque la taille de l’échantillon atteint la plage de millimètre en raison de la grande profondeur focale des lentilles de grossissement faible. Par exemple, la profondeur focale atteint plus de 50 µm lorsqu’un 10 x grossissement objectif est utilisé alors que la taille de la cellule unique est normalement inférieur à 10 µm. Afin d’améliorer la qualité d’imagerie, systèmes de microscopie de haute technologie sont développées (p. ex., microscopie biphotonique11 et système de microscopie de lumière-fiche12), mais leur disponibilité est limitée en raison de leur prix élevé. Comme alternative, nous avons déjà développé un hybride gel cube (HGC) dispositif13. Le dispositif se compose de deux types d’hydrogels : gel d’agarose comme un gel de l’aide et un ECM comme le collagène ou Matrigel comme un gel de la culture. Le HGC permet de recueillir les échantillons au cours de la mise en culture et faire pivoter le cube pour atteindre l’imagerie multidirectionnel, qui aborde le problème de profondeur focale14.
Une autre difficulté dans des expériences 3D est leur faible répétabilité en raison de la piètre contrôlabilité des environnements 3D. Contrairement à une culture plane sur un plat en plastique, des variations dans les conditions de culture initiale se produisent facilement dans un espace 3D, entouré d’un matériau doux. Une variation significative dans les résultats expérimentaux détériore l’analyse qui suit et qui masque les mécanismes sous-jacents. Ingénierie de nombreuses technologies ont été développées pour aligner dans l’espace des cellules individuelles, par exemple bioprinting15,16,17et18d’échafaudage, de tissage de fibres, mais elles nécessitent un prétraitement complexes ou spécifiquement matériel conçu. En revanche, nous avons développé une méthodologie pour réaliser l’alignement de cellule 3D dans un HGC19.
Dans ce protocole, nous montre une procédure simple avec équipement couramment utilisé pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale 3D dans un HGC. Tout d’abord, le processus de fabrication de la HGC a été démontré. Puis, micromolds fabriquées par photolithographie ou un processus d’usinage ont été placés dans la HGC pour produire une poche avec une forme arbitraire dans un ECM. Par la suite, des cellules très denses après centrifugation ont été injectées dans la poche pour contrôler la forme de grappe de cellule initiale dans la HGC. L’amas de cellule contrôlée avec précision pourrait être photographié de nombreuses directions en raison de la HGC. Normal humain (NHBE) les cellules épithéliales bronchiques ont été utilisées pour démontrer le contrôle de la forme de grappe de cellule initiale et l’imagerie des branches dans des directions multiples, pour améliorer la qualité d’imagerie.
La méthode présentée dans cet article est simple et peut s’effectuer sans le matériel de haute technologie. Parallèlement, un résultat de contrôle précis cell cluster forme dans l’espace 3D d’hydrogel peut être obtenu. Après le contrôle initial, les cellules peuvent croître dans la HGC autant qu’ils sont cultivés sur un plat. L’imagerie multidirectionnelle s’effectue en faisant tourner l’échantillon avec la HGC en utilisant n’importe quel système de microscopie, et il améliore considérabl…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu financièrement par JSPS KAKENHI (18H 04765) et le programme à diffuser Tenure Track System, MEXT, Japon.
12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
AZ1512 | Merck | ||
BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |