نمو وتوصيف العضوية المشعة من الغدد الثديية
Summary
تم المشعة التي وضعت من الغدد الثديية الماوس وتتميز لتقييم الصفات الظهاريه والتفاعلات مع الخلايا المناعية. يمكن استخدام العضوية المشعة لتحسين تقييم تفاعلات خلايا الخلايا التي قد تؤدي إلى تجنيد الخلايا السرطانية في الانسجه الطبيعية المشعة.
Abstract
العضوية المشتقة من الانسجه المهضومة هي بني متعددة الخلايا ثلاثية الابعاد (3D) التي تلخص أفضل في ظروف الجسم الخلوي من أحاديه الخلية. علي الرغم من انها لا يمكن ان نموذج تماما في تعقيد المجرية ، فانها تحتفظ ببعض وظائف الجهاز الأصلي. في نماذج السرطان ، وتستخدم عاده organoids لدراسة الورم الخلية الغزو. يهدف هذا البروتوكول إلى تطوير وتوصيف الخلايا العضوية من انسجه الغدد الثديية العادية والمشعة للماوس لتقييم الاستجابة الاشعاعيه في الانسجه الطبيعية. هذه العضوية يمكن تطبيقها علي دراسات السرطان في المستقبل في المختبر لتقييم تفاعلات الخلايا السرطانية مع العضوي المشع. تم تقسيم الغدد الثديية ، المشع إلى 20 غراي وهضمها في محلول الثامن كولاجيناز. تم فصل العضوية الظهاريه عن طريق التمايز الطرد المركزي ، ووضعت العضوية الثلاثية الابعاد في الصفائح الدقيقة المنخفضة التصاق 96-حسنا. وأعرب organoids علامة ظهاري مميزه سيتوكيراتين 14. لوحظ تفاعل الضامة مع الهيكل العضوي في التجارب المشتركة في الثقافة. قد يكون هذا النموذج مفيدا لدراسة التفاعلات بين الأورام ، وتسلل الخلايا المناعية ، والاستقطاب الضام داخل بيئة مجهريه مشعة.
Introduction
حوالي 60 ٪ من المرضي سرطان الثدي الثلاثي السلبية (TNBC) اختيار العلاج الحفاظ علي الثدي (BCT) كشكل من اشكال العلاج1. في هذه الطريقة العلاج ، يتم أزاله الورم الذي يحتوي علي جزء من انسجه الثدي ، ويتعرض الانسجه الطبيعية المحيطة للإشعاع المؤين لقتل اي خلايا الورم المتبقية. العلاج يقلل من تكرار في الكثير من السكان سرطان الثدي. ومع ذلك ، ما يقرب من 13.5 ٪ من المرضي المعالجين مع TNBC تجربه التكرارات الاقليميه2. ولذلك ، فان دراسة كيفيه توظيف الإشعاع الخلايا السرطانية المتداولة (ctcs) سوف يؤدي إلى رؤى هامه في تكرار المحلية3،4.
وقد أظهرت الاعمال السابقة ان الإشعاع من الانسجه الطبيعية يزيد من توظيف أنواع مختلفه من الخلايا5. في نماذج ما قبل السريرية من TNBC ، والتشعيع من الانسجه الطبيعية زيادة الضامة وبعد ذلك الورم الخلايا التوظيف إلى الانسجه الطبيعية5. وقد أثرت حاله المناعة علي تجنيد الخلايا السرطانية في المواقع المشعة ، مع ملاحظه هجره الخلايا السرطانية في المواد المناعية. تلخيص هذه التفاعلات باستخدام organoids المستمدة من الغدد الثديية سوف تسمح بمراقبه هجره الخلايا والتفاعلات الخلوية في الوقت الحقيقي مع المجهر والتصوير الخلوي الحي لتحديد دور الضرر الإشعاعي في تغيير سلوك الخلايا السرطانية.
ساعدت الغدد الثديية الماوس توضيح الخطوات الرئيسية في تطوير الغدة الثديية. و organoid الثديية هي متعددة الخلايا ، وبناء ثلاثي الابعاد من ظهاره الثديية المعزولة التي هي أكبر من 50 μm6، 7،8،9،10. باستخدام العضوية الظهاريه الاوليه ، Simian وآخرون تقييم العوامل اللازمة لتفريع في الغدة الثديية7. اكتشف شامير وآخرون ان النشر يمكن ان يحدث دون ظهاره للانتقال المستوي ، وتوفير نظره ثاقبه علي تتالي المنتشر8. طرق لتوليد وتوصيف العضوية من انسجه الغدد الثديية راسخة6,11,12,13. ومع ذلك ، علي حد علمنا ، لم يتم الإبلاغ عن أساليب لزراعه العضوية المشعة من الغدد الثديية. ومن شان وضع بروتوكول لزراعه وتوصيف الخلايا العضوية المشعة ان يكون خطوه حاسمه في تلخيص المناعة المستحثة بالإشعاع والتجنيد في الخلية السرطانية.
في هذه الورقة ، ونحن الإبلاغ عن طريقه لزراعه وتوصيف المشعة الثديية الظهاريه العضوية في الصفائح الدقيقة التصاق منخفضه المغلفة مع البوليمر ماء التي تدعم تشكيل خزان. وكانت هذه العضوية المستزرعة مع الضامة لفحص حركيه تسلل الخلايا المناعية. ويمكن توسيع هذا العمل لتشمل المشاركة في زراعه العضوية مع الخلايا الدهنية لتلخيص الخصائص الثديية, خلايا سرطان الثدي لتصور تجنيد الخلايا السرطانية, وخلايا CD8 + T لدراسة التفاعلات الخلايا المناعية الورم. ويمكن استخدام البروتوكولات المنشاة سابقا لتقييم العضوية المشعة. وقد سلطت النماذج السابقة المشاركة في التشكيل العضوي الثديي والخلايا المناعية الضوء علي أليات الانبثاث والنشر. وقد وجدت DeNardo وآخرون ان التنظيم الخلية الخلايا التائية + T من الضامة المرتبطة الورم تعزيز النمط الظاهري المنتشر من الأورام اللحمية الثديية14. كما استخدمت نماذج الثقافة المشتركة لتوضيح أليات التنمية البيولوجية. Plaks et al. أوضح دور الخلايا التائية + T كما أسفل المنظمين من العضوي الثديية15. ومع ذلك ، فان مجموعتنا هي أول من يؤسس اجراء لتصور كيف يؤثر تشعيع الانسجه الطبيعية علي سلوك الخلايا المناعية. لأنه قد ثبت تشعيع الانسجه العادية لتعزيز تجنيد الخلايا السرطانية5، يمكن تطوير هذا البروتوكول لتحليل كيفيه تغيير سلوك الخلايا السرطانية عن طريق تشعيع الانسجه الطبيعية والخلايا ، مما يؤدي إلى فهم أكبر تكرار السرطان.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول ، قمنا بتطوير طريقه لنمو وتوصيف الغدد الثديية المشعة التي يمكن استنساخها (الشكل 1). تم تطبيق جرعه التشعيع من 20 غراي لتعكس السابقة في نماذج الجسم الخارجي من الخلايا السرطانية التوظيف5. تشعيع الغدد الثديية السابقة الجسم العضوي قبل تشكيل organoid يس?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتورة لورا ل. Bronsart لتوفير GFP و dTomato-المسمي RAW 264.7 الضامة. تم دعم هذا البحث ماليا من قبل منحه المعاهد القومية للصحة #R00CA201304.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
| Collagen Type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |
Referencias
- Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
- Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
- Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Investigación sobre el cáncer. 78 (15), 4241-4252 (2018).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, 3117-3131 (2001).
- Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
- Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
- Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews. , (2018).
- DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
- Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
- Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
- Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Bioquímica. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
- Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
- Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
- Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
- Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, 4229-4238 (2010).
- Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding Adipocyte Differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
- Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
- Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
- Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).
