Органоиды, разработанные из молочных желез мышей были облучены и характеризуется для оценки эпителиальных признаков и взаимодействий с иммунными клетками. Облученных органоиды могут быть использованы для более эффективного оценки клеточных взаимодействий клеток, которые могут привести к набору опухолевых клеток в облучении нормальной ткани.
Органоиды, получаемые из переваренной ткани, представляют собой многоклеточные трехмерные (3D) конструкции, которые лучше повторяют условия естественных условий, чем моноайеры клеток. Хотя они не могут полностью моделировать в естественных условиях сложности, они сохраняют некоторую функциональность оригинального органа. В моделях рака, органоиды обычно используются для изучения вторжения опухолевых клеток. Этот протокол направлен на разработку и характеристику органоидов из нормальной и облученных мышей молочной железы ткани для оценки радиационной реакции в нормальных тканях. Эти органоиды могут быть применены к будущему в пробирке рака исследований для оценки взаимодействия опухолевых клеток с облученных органоидов. Молочные железы были resected, облученных до 20 гр и усваивается в коллагеназы VIII раствора. Эпителиальные органоиды были отделены через центробежные дифференцировки, и 3D органоиды были разработаны в 96-хорошо низкой адгезии микропластин. Органоиды выразили характерный эпителиальный маркер цитокератина 14. Взаимодействие макрофагов с органоидами наблюдалось в экспериментах со-культуры. Эта модель может быть полезна при изучении опухолей-стромальных взаимодействий, инфильтрации иммунных клеток и поляризации макрофагов в облученном микроокружении.
Примерно 60% от тройной отрицательный рак молочной железы (TNBC) пациенты выбирают грудного сохранения терапии (BCT) в качестве одной из форм лечения1. В этом модальности лечения, опухоль, содержащая часть ткани молочной железы удаляется, и окружающие нормальные ткани подвергается воздействию ионизирующего излучения, чтобы убить любые остаточные опухолевые клетки. Лечение уменьшает рецидив в большей части населения рака молочной железы; Тем не менее, примерно 13,5% пациентов с TNBC опыт локализрегионарно рецидивов2. Таким образом, изучая, как излучение может набирать циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) приведет к важным понимание местных рецидивов3,4.
Предыдущая работа показала, что излучение нормальных тканей увеличивает набор различных типов клеток5. В доклинических моделях TNBC, облучение нормальных тканей увеличенного макрофага и впоследствии набора опухолевых клеток к нормальным тканям5. Иммунный статус повлиял на набор опухолевых клеток в облученных участках, с миграцией опухолевых клеток наблюдается у субъектов с ослабленным иммунитетом. Резюме этих взаимодействий с использованием органоидов, полученных из молочных желез позволит наблюдение клеточной миграции и клеток стромальных взаимодействий в режиме реального времени с микроскопией и живой визуализации клеток, чтобы определить роль радиационного повреждения в изменении поведение опухолевых клеток.
Органоиды молочных мышей помогли прояснить ключевые шаги в развитии молочной железы. Оргаоид молочной железы представляет собой многоклеточный, трехмерный конструкт изолированного молочной эпителия, который больше 50 мкм6,7,8,9,10. Используя первичные эпителиальные органоиды, Симиан и др. оценивали необходимые факторы для ветвления в молочной железе7. Шамир и др. обнаружили, что распространение может происходить без эпителиального мезенхимального перехода, обеспечивая понимание метастатического каскада8. Методы генерации и характеристики органоидов из ткани молочной железы хорошо созданы6,11,12,13. Однако, насколько нам известно, о методах выращивания облученных органоидов из молочных желез не сообщалось. Протокол для выращивания и характерирования облученных органоидов был бы критическим шагом в переподборе индуцированных радиацией иммунных и опухолевых клеток.
В данной статье мы сообщаем о методе выращивания и характеризующих облученных в низкоадгезиальных микропластиках молочных эпителиоидов, покрытых гидрофильным полимером, поддерживающего формирование сфероидов. Эти органоиды были совместно культивировали с макрофагами, чтобы изучить кинетику проникновения иммунной клетки. Эта работа может быть расширена за включение совместного культивирования органоиды с жировой клетки, чтобы резюмировать молочных характеристик, клетки рака молочной железы для визуализации опухоли клеток набора, и CD8 + т-клеток для изучения опухоли иммунных взаимодействий клеток. Ранее установленные протоколы могут использоваться для оценки облученных органоидов. Более ранние модели совместного культивирования молочных органоидов и иммунных клеток проливают свет на механизмы метастазов и распространения. Денардо и др. обнаружили, что CD4 + т-клеточной регуляции опухоли связанных макрофагов расширенной метастатического фенотипа молочной аденокарциномы14. Для выяснения механизмов биологического развития использовались также модели сокультуры. Плакс и др. уточнили роль CD4 + т-клеток в качестве регуляторов молочной оргагенеза15. Тем не менее, наша группа является первой, чтобы установить процедуру визуализации, как нормальное облучение тканей влияет на поведение иммунной клетки. Потому что нормальное облучение ткани было показано, что увеличить набор опухолевых клеток5, этот протокол может быть дополнительно разработан, чтобы проанализировать, как поведение опухолевых клеток изменяется путем облучения нормальных тканей и клеток, что приводит к большему пониманию рецидива рака.
В этом протоколе мы разработали метод воспроизводимых темпов роста и характеризации облученных молочных органоидов (рис. 1). Доза облучения 20 гр был применен для зеркала предыдущего в естественных условиях модели набора опухолевых клеток5. Облучение молочн…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим д-р Лаура л. Бронсар для обеспечения GFP и Dтомат-помечены RAW 264,7 макрофагов. Это исследование было финансово поддержано субсидии низ #R00CA201304.
10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
Collagen Type I | Corning | 354236 | |
Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
DNAse | Roche | 10104159001 | |
DPBS | Fisher | 14190250 | |
E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
FBS | Sigma | F0926 | |
Gentamicin | Gibco | 15750 | |
Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
PBS | VWR | 10128-856 | |
Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |