Croissance et caractérisation des organoïdes irradiés des glandes mammaires
Summary
Les organoïdes développés à partir de glandes mammaires de souris ont été irradiés et caractérisés pour évaluer les traits épithéliaux et les interactions avec les cellules immunitaires. Les organoïdes irradiés peuvent être utilisés pour mieux évaluer les interactions de cellules cellulaires qui peuvent conduire au recrutement de cellules tumorales dans le tissu normal irradié.
Abstract
Les organoïdes dérivés du tissu digéré sont des constructions tridimensionnelles (3D) multicellulaires qui mieux récapitulent les conditions in vivo que les monocouches cellulaires. Bien qu’ils ne puissent pas complètement modéliser la complexité in vivo, ils conservent certaines fonctionnalités de l’orgue d’origine. Dans les modèles de cancer, les organoïdes sont couramment utilisés pour étudier l’invasion de cellules tumorales. Ce protocole vise à développer et caractériser les organoïdes du tissu de la glande mammaire de souris normale et irradiée pour évaluer la réponse de rayonnement dans les tissus normaux. Ces organoïdes peuvent être appliqués à de futures études de cancer in vitro pour évaluer les interactions des cellules tumorales avec des organoïdes irradiés. Les glandes mammaires ont été retouchées, irradiées à 20 Gy et digérées dans une solution de collagénase VIII. Les organoïdes épithéliaux ont été séparés par une différenciation centrifuge, et des organoïdes 3D ont été développés dans des microplaques à faible adhérence à 96 puits. Les organoïdes ont exprimé la cytokératine du marqueur épithélial caractéristique 14. L’interaction macrophage avec les organoïdes a été observée dans des expériences de co-culture. Ce modèle peut être utile pour étudier les interactions tumeur-stromale, l’infiltration des cellules immunitaires et la polarisation des macrophages dans un microenvironnement irradié.
Introduction
Environ 60% des patients atteints de cancer du sein à triple négatif (TNBC) choisissent une thérapie de conservation du sein (BCT) comme forme de traitement1. Dans cette modalité de traitement, la tumeur contenant une partie du tissu mammaire est enlevée, et le tissu normal environnant est exposé aux rayonnements ionisants pour tuer les cellules tumorales résiduelles. Le traitement réduit la récurrence dans une grande partie de la population de cancer du sein; Cependant, environ 13,5% des patients traités par TNBC éprouvent des récidives locorégionales2. Par conséquent, étudier comment le rayonnement peut recruter des cellules tumorales circulantes (CTCS) mènera à des aperçus importants sur la récurrence locale3,4.
Des travaux antérieurs ont montré que le rayonnement du tissu normal augmente le recrutement de divers types de cellules5. Dans les modèles précliniques de TNBC, l’irradiation du tissu normal augmentait le macrophages et subséquemment le recrutement des cellules tumorales dans les tissus normaux5. Le statut immunitaire a influencé le recrutement des cellules tumorales sur les sites irradiés, avec la migration des cellules tumorales observée chez les sujets immunodéprimés. La récapitulation de ces interactions à l’aide d’organoïdes dérivés de glandes mammaires permettra l’observation de la migration cellulaire et des interactions cellules-stromales en temps réel avec la microscopie et l’imagerie cellulaire en direct afin de déterminer le rôle des dommages causés par les radiations lors de l’altération comportement des cellules tumorales.
Souris mammaires organoïdes ont contribué à élucider les étapes clés dans le développement de la glande mammaire. Un organoïde mammaire est une construction multicellulaire en trois dimensions de l’épithélium mammaire isolé qui est plus grand que 50 μM6,7,8,9,10. À l’aide d’organoïdes épithéliaux primaires, Simian et coll. ont évalué les facteurs nécessaires à la ramification dans la glande mammaire7. Shamir et coll. ont découvert que la dissémination peut se produire sans transition épithéliale à médéchymateuses, ce qui donne un aperçu de la cascade métastatique8. Les méthodes de production et de caractérisation des organoïdes du tissu de la glande mammaire sont bien établies6,11,12,13. Cependant, à notre connaissance, les méthodes de croissance des organoïdes irradiés des glandes mammaires n’ont pas été rapportées. Un protocole pour la culture et la caractérisation des organoïdes irradiés serait une étape cruciale dans la récapitulation du recrutement immunitaire et des cellules tumorales induite par le rayonnement.
Dans cet article, nous rapmettons une méthode pour cultiver et caractériser les organoïdes épithéliaux mammaires irradiés dans des microplaques à faible adhérence recouvertes d’un polymère hydrophile qui soutient la formation de sphéroïïdes. Ces organoïdes ont été co-cultivés avec des macrophages pour examiner la cinétique d’infiltration des cellules immunitaires. Ce travail peut être étendu pour inclure les organoïdes de co-culturing avec les cellules adipeuses pour récapituler les caractéristiques mammaires, les cellules cancéreuses du sein pour visualiser le recrutement de cellules tumorales, et les cellules de T + + T pour étudier les interactions de cellules de tumeur-immunes. Des protocoles préalablement établis peuvent être utilisés pour évaluer les organoïdes irradiés. Les modèles antérieurs co-culturant les organoïdes mammaires et les cellules immunitaires ont mis en lumière les mécanismes de métastase et de dissémination. DeNardo et coll. ont constaté que la régulation des lymphocytes T CD4 + des macrophages associés aux tumeurs a amélioré le phénotype métastatique des adénocarcinomes mammaires14. Des modèles de co-culture ont également été utilisés pour élucider les mécanismes de développement biologique. Plaks et coll. ont clarifié le rôle des lymphocytes T CD4 + comme régulateurs de bas de l’organogenèse mammaire15. Cependant, notre groupe est le premier à établir une procédure de visualisation de la façon dont l’irradiation tissulaire normale influe sur le comportement des cellules immunitaires. Parce que l’irradiation normale des tissus a été montré pour améliorer le recrutement de cellules tumorales5, ce protocole peut être développé pour analyser comment le comportement des cellules tumorales est altéré par l’irradiation des tissus normaux et des cellules, conduisant à une meilleure compréhension de récidive du cancer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous avons développé une méthode pour la croissance reproductible et la caractérisation des organoïdes des mammaires irradiés (figure 1). Une dose d’irradiation de 20 GY a été appliquée pour refléter les précédents modèles in vivo de recrutement de cellules tumorales5. L’irradiation des glandes mammaires ex vivo avant la formation organoïde a permis l’isolement des effets de dommages de rayonnement sans infiltration correspondant…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Laura L. BRONSART d’avoir fourni des macrophages bruts 264,7 de GFP et de dTomato. Cette recherche a été financée financièrement par la subvention NIH #R00CA201304.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
| Collagen Type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |
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