Crescita e caratterizzazione di organoidi irradiati da ghiandole mammarie
Summary
Gli organoidi sviluppati dalle ghiandole mammarie del topo sono stati irradiati e caratterizzati per valutare i tratti epiteliali e le interazioni con le cellule immunitarie. Gli organoidi irradiati possono essere utilizzati per valutare meglio le interazioni delle cellule cellulari che possono portare al reclutamento di cellule tumorali nel tessuto normale irradiato.
Abstract
Gli organoidi derivati dal tessuto digerito sono costrutti tridimensionali (3D) multicellulari che ricapitolano meglio le condizioni in vivo rispetto ai monostrati cellulari. Anche se non possono modellare completamente la complessità in vivo, mantengono alcune funzionalità dell’organo originale. Nei modelli tumorali, gli organoidi sono comunemente usati per studiare l’invasione delle cellule tumorali. Questo protocollo mira a sviluppare e caratterizzare gli organoidi dal normale e irradiato tessuto della ghiandola mammaria del topo per valutare la risposta alle radiazioni nei tessuti normali. Questi organoidi possono essere applicati a futuri studi di cancro in vitro per valutare le interazioni delle cellule tumorali con organoidi irradiati. Le ghiandole mammarie sono state resecate, irradiate a 20 GY e digerite in una soluzione di collagenasi VIII. Gli organoidi epiteliali sono stati separati tramite differenziazione centrifuga e gli organoidi 3D sono stati sviluppati in micropiastre 96 e a bassa adesione. Gli organoidi hanno espresso il caratteristico marcatore epiteliale citcheratina 14. L’interazione macrofage con gli organoidi è stata osservata negli esperimenti di co-coltura. Questo modello può essere utile per studiare le interazioni tumorale-stromali, l’infiltrazione delle cellule immunitarie e la polarizzazione dei macrofati all’interno di un microambiente irradiato.
Introduction
Circa il 60% dei pazienti con triplo cancro al seno negativo (TNBC) sceglie la terapia di conservazione del seno (BCT) come forma di trattamento1. In questa modalità di trattamento, il tumore contenente parte del tessuto mammario viene rimosso, e il tessuto normale circostante è esposto a radiazioni ionizzanti per uccidere eventuali cellule tumorali residue. Il trattamento riduce la recidiva in gran parte della popolazione di cancro al seno; Tuttavia, circa 13,5% dei pazienti trattati con TNBC esperienza locoregionale recidive2. Pertanto, studiando come la radiazione può reclutare cellule tumorali circolanti (CTCs) porterà a importanti approfondimenti sulla ricorrenza locale3,4.
Il lavoro precedente ha dimostrato che la radiazione del tessuto normale aumenta il reclutamento di vari tipi di cellule5. Nei modelli preclinici di TNBC, l’irradiazione del tessuto normale ha aumentato il macrofago e successivamente il reclutamento delle cellule tumorali nei tessuti normali5. Stato immunitario influenzato il reclutamento delle cellule tumorali nei siti irradiati, con la migrazione delle cellule tumorali osservata in soggetti immunocompromessi. Ricapitolando queste interazioni utilizzando organoidi derivati da ghiandole mammarie permetterà l’osservazione della migrazione cellulare e interazioni cellulare-stromali in tempo reale con microscopia e imaging cellulare vivo per determinare il ruolo del danno da radiazioni in alterare comportamento delle cellule tumorali.
Gli organoidi mammari del topo hanno aiutato a chiarire i passi chiave nello sviluppo della ghiandola mammaria. Un organoide mammario è un costrutto tridimensionale multicellulare di epitelio mammario isolato che è più grande di 50 μm6,7,8,9,10. Usando organoidi epiteliali primari, Simian et al. ha valutato i fattori necessari per la ramificazione nella ghiandola mammaria7. Ha scoperto che la diffusione può avvenire senza una transizione epiteliale a mesenchimale, fornendo informazioni sulla cascata metastatica8. I metodi per la generazione e la caratterizzazione di organoidi dal tessuto della ghiandola mammaria sono ben consolidati6,11,12,13. Tuttavia, a nostra conoscenza, non sono stati segnalati metodi per la coltivazione di organoidi irradiati da ghiandole mammarie. Un protocollo per la coltivazione e la caratterizzazione di organoidi irradiati sarebbe un passo critico nella ricapitolazione del reclutamento di cellule immunitarie e tumorali indotta da radiazioni.
In questo articolo riportiamo un metodo per coltivare e caratterizzare organoidi epiteliali mammari irradiati in micropiastre a bassa adesione rivestite con un polimero idrofilo che supporta la formazione di sferoidi. Questi organoidi sono stati co-coltivati con macrofagi per esaminare la cinetica di infiltrazione delle cellule immunitarie. Questo lavoro può essere esteso per includere organoidi co-coltura con cellule adiposo per ricapitolare caratteristiche mammarie, cellule di cancro al seno per visualizzare il reclutamento delle cellule tumorali, e CD8 + cellule T per studiare le interazioni del tumore-immunitarie. I protocolli precedentemente stabiliti possono essere utilizzati per valutare gli organoidi irradiati. I modelli precedenti che cocoltivano organoidi mammari e cellule immunitarie hanno fatto luce sui meccanismi di metastasi e diffusione. Ha riscontrato che la regolazione delle cellule T CD4 + dei macrofagi associati al tumore ha migliorato un fenotipo metastatico di adenocarcinomi mammari14. I modelli di co-coltura sono stati utilizzati anche per chiarire i meccanismi di sviluppo biologico. Chiarito il ruolo delle cellule T CD4 + come down-regolatori di organogenesi mammaria15. Tuttavia, il nostro gruppo è il primo a stabilire una procedura per visualizzare come l’irraggiamento del tessuto normale influenza il comportamento delle cellule immunitarie. Poiché l’irraggiamento tissutale normale è stato dimostrato per migliorare il reclutamento delle cellule tumorali5, questo protocollo può essere ulteriormente sviluppato per analizzare come il comportamento delle cellule tumorali è alterato dall’irradiazione di tessuti e cellule normali, portando ad una maggiore comprensione del recidiva di cancro.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, abbiamo sviluppato un metodo per la crescita riproducibile e la caratterizzazione di organoidi mammari irradiati (Figura 1). Una dose di irradiazione di 20 GY è stata applicata allo specchio precedenti modelli in vivo di reclutamento di cellule tumorali5. L’irradiazione delle ghiandole mammarie ex vivo prima della formazione organoide ha permesso di isolare gli effetti di danno da radiazioni senza una corrispondente infiltrazione di cellule immu…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la Dott. ssa Laura L. Bronsart per aver fornito GFP e i macrofagi RAW 264,7 con etichetta dTomato. Questa ricerca è stata sostenuta finanziariamente da NIH Grant #R00CA201304.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
| Collagen Type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |
Referencias
- Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
- Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
- Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Investigación sobre el cáncer. 78 (15), 4241-4252 (2018).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, 3117-3131 (2001).
- Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
- Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
- Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews. , (2018).
- DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
- Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
- Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
- Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Bioquímica. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
- Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
- Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
- Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
- Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, 4229-4238 (2010).
- Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding Adipocyte Differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
- Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
- Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
- Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).
