Summary

Crecimiento y caracterización de organoides irradiados de glándulas mamarias

Published: May 03, 2019
doi:

Summary

Los organoides desarrollados a partir de glándulas mamarias de ratones fueron irradiados y caracterizados para evaluar rasgos epiteliales e interacciones con las células inmunitarias. Los organoides irradiados se pueden utilizar para evaluar mejor las interacciones de células celulares que pueden conducir al reclutamiento de células tumorales en tejido normal irradiado.

Abstract

Los organoides derivados del tejido digerido son construcciones tridimensionales (3D) multicelulares que mejor recapitulan las condiciones in vivo que las monocapas celulares. Aunque no pueden modelar completamente la complejidad in vivo, conservan alguna funcionalidad del órgano original. En los modelos de cáncer, los organoides se utilizan comúnmente para estudiar la invasión de células tumorales. Este protocolo tiene como objetivo desarrollar y caracterizar los organoides del tejido de las glándulas mamarias de ratones irradiados y normales para evaluar la respuesta a la radiación en los tejidos normales. Estos organoides se pueden aplicar a futuros estudios de cáncer in vitro para evaluar las interacciones de células tumorales con organoides irradiados. Las glándulas mamarias fueron reeliminadas, irradiadas a 20 GY y digerida en una solución de colagenasa VIII. Los organoides epiteliales fueron separados a través de la diferenciación centrífuga, y los organoides 3D fueron desarrollados en microplacas de baja adherencia de 96-well. Los organoides expresaron el característico marcador epitelial citoqueratina 14. La interacción de los macrófagos con los organoides se observó en experimentos de co-cultivo. Este modelo puede ser útil para estudiar interacciones tumor-stromal, infiltración de células inmunitarias y polarización de macrófagos dentro de un microambiente irradiado.

Introduction

Aproximadamente el 60% de los pacientes con cáncer de mama triple negativo (TNBC) eligen la terapia de conservación de mamas (BCT) como forma de tratamiento1. En esta modalidad de tratamiento, se extrae el tumor que contiene parte del tejido mamario y el tejido normal circundante se expone a la radiación ionizante para eliminar las células tumorales residuales. El tratamiento reduce la recurrencia en gran parte de la población de cáncer de mama; sin embargo, aproximadamente el 13,5% de los pacientes tratados con TNBC experimentan recurrencias locoregionales2. Por lo tanto, estudiar cómo la radiación puede reclutar células tumorales circulantes (CTCS) dará lugar a información importante sobre la recurrencia local3,4.

El trabajo anterior ha demostrado que la radiación del tejido normal aumenta el reclutamiento de varios tipos de células5. En los modelos preclínicos de TNBC, la irradiación del tejido normal aumentó el macrófago y posteriormente el reclutamiento de células tumorales a los tejidos normales5. El estado inmune influyó en el reclutamiento de células tumorales en sitios irradiados, con migración de células tumorales observadas en sujetos inmunodeprimido. La recapitulación de estas interacciones utilizando organoides derivados de glándulas mamarias permitirá la observación de la migración celular y las interacciones celular-stromal en tiempo real con la microscopía y las imágenes de células vivas para determinar el papel del daño por radiación en la alteración comportamiento de las células tumorales.

Los organoides mamarios de ratones han ayudado a aclarar los pasos clave en el desarrollo de la glándula mamaria. Un organoide mamario es una construcción tridimensional multicelular de epitelio mamario aislado que es más grande que 50 μm6,7,8,9,10. Utilizando los organoides epiteliales primarios, Simian y otros evaluaron los factores necesarios para la ramificación en la glándula mamaria7. Shamir y otros descubrieron que la diseminación puede ocurrir sin un epitelio a la transición mesenquimal, proporcionando una visión de la cascada metastásica8. Los métodos para generar y caracterizar los organoides del tejido de las glándulas mamarias están bien establecidos6,11,12,13. Sin embargo, según nuestro conocimiento, no se han notificado métodos para cultivar organoides irradiados a partir de glándulas mamarias. Un protocolo para cultivar y caracterizar los organoides irradiados sería un paso crítico en la recapitulación del reclutamiento inmunológico inducido por radiación y de células tumorales.

En este documento, se informa de un método para cultivar y caracterizar los organoides epiteliales mamarios irradiados en microplacas de baja adherencia recubiertas con un polímero hidrófilo que apoya la formación de esferoides. Estos organoides fueron cocultivados con macrófagos para examinar la cinética de infiltración de células inmunitarias. Este trabajo se puede ampliar para incluir organoides de coculturación con células adiposas para recapitular características mamarias, células de cáncer de mama para visualizar el reclutamiento de células tumorales, y las células T CD8 + para estudiar las interacciones de células inmunes del tumor. Se pueden utilizar protocolos previamente establecidos para evaluar los organoides irradiados. Los modelos anteriores que coculturan los organoides mamarios y las células inmunitarias han arrojar luz sobre los mecanismos de metástasis y diseminación. DeNardo y otros descubrieron que la regulación de linfocitos T CD4 + de los macrófagos asociados al tumor mejoró un fenotipo metastásico de adenocarcinomas mamarios14. También se han utilizado modelos de cocultivo para dilucidar los mecanismos de desarrollo biológico. Plaks et al. aclaró el papel de las células T CD4 + como reguladores de la organogénesis mamaria15. Sin embargo, nuestro grupo es el primero en establecer un procedimiento para visualizar cómo la irradiación del tejido normal influye en el comportamiento de las células inmunes. Debido a que se ha demostrado que la irradiación del tejido normal mejora el reclutamiento de células tumorales5, este protocolo se puede desarrollar aún más para analizar cómo el comportamiento de las células tumorales se altera por la irradiación del tejido y las células normales, lo que conduce a una mayor comprensión de recurrencia del cáncer.

Protocol

Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales y protocolos aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad de Vanderbilt. 1. preparación de ratones y adquisición celular (adaptado de Nguyen-Ngoc et al.11) Sacrificar ratones nu/nu atímicos (8-10 semanas de edad) usando asfixia por Co2 seguida de luxación cervical. Limpie la piel con etanol al 70%. Resect las glánd…

Representative Results

Los organoides epiteliales irradiados se obtuvieron con éxito a partir de glándulas mamarias de ratones, procesadas y cultivadas en placas de baja adherencia (figura 1). El rendimiento organoide se probó por siembra en diferentes ambientes de crecimiento (figura 2A-G). Las células de siembra directamente en el cultivo de tejidos tratados con placas de células de 10 cm produjeron un crecimiento excesivo de células de fibroblastos. Los fibroblastos fueron identificados b…

Discussion

En este protocolo, hemos desarrollado un método para el crecimiento reproducible y la caracterización de los organoides mamarios irradiados (figura 1). Se aplicó una dosis de irradiación de 20 GY para reflejar los modelos anteriores in vivo de reclutamiento de células tumorales5. La irradiación de las glándulas mamarias ex vivo antes de la formación organoide permitió el aislamiento de los efectos de daño por radiación sin una infiltración correspondiente …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a la Dra. Laura L. Bronsart por proveer los macrófagos RAW 264,7 etiquetados con GFP y dTomato. Esta investigación fue apoyada financieramente por la beca NIH #R00CA201304.

Materials

10% Neutral Buffered Formalin VWR 16004-128
Anti-cytokeratin 14 abcam ab181595 Lot: GR3200524-3
Bovine Serum Albumin Sigma A1933-25G
Collagen Type I Corning 354236
Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII Sigma C2139
Collagenase I Gibco 17018029
DMEM/F12 Thermofisher 11320-033
DNAse Roche 10104159001
DPBS Fisher 14190250
E-Cadherin Cell Signaling 24E10 Lot: 13
FBS Sigma F0926
Gentamicin Gibco 15750
Goat anti-rabbit secondary abcam ab150077 green
Lot: GR3203000-1
Goat anti-rabbit secondary abcam ab150080 red
Lot: GR3192711-1
Hoechst 33342 Fisher 62249 Lot: TG2611041
Insulin (10 mg/mL) Sigma I9278
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x Gibco 51500-056
Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) Corning 356237
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000
Nuclon Sphera 96 well plates Thermo 174927
PBS VWR 10128-856
Pen/strep Fisher 15140122
Phalloidin abcam ab176757 Lot: GR3214582-16
Tight Junction Protein 1 Novus NBP1-85047 Lot: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) Sigma X100-100ML
Trypsin Gibco 27250-018
Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) Sigma P1379-100ML

Referencias

  1. Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
  2. Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
  3. Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  4. Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
  5. Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Investigación sobre el cáncer. 78 (15), 4241-4252 (2018).
  6. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  7. Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, 3117-3131 (2001).
  8. Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
  9. Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
  10. Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
  11. Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
  12. Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
  13. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews. , (2018).
  14. DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
  15. Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
  16. Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
  17. Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
  18. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Bioquímica. 23 (13), 3085-3091 (1984).
  19. Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
  20. Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
  21. Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
  22. Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
  23. LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  24. Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
  25. Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
  26. Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, 4229-4238 (2010).
  27. Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding Adipocyte Differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
  28. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  29. Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
  30. Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
  31. Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
  32. Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).
check_url/es/59293?article_type=t

Play Video

Citar este artículo
Hacker, B. C., Gomez, J. D., Batista, C. A. S., Rafat, M. Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands. J. Vis. Exp. (147), e59293, doi:10.3791/59293 (2019).

View Video