Mesure des taux potentiels de réduction du nitrate dissimilatoire à l’ammonium sur la base de 14NH4+/15NH4+ Analyses via conversion séquentielle en N2O
Summary
Une série de méthodes pour déterminer le taux potentiel de DNRA sur la base de 14NH4+/15NH4+ analyses est fournie en détail. NH4+ est converti en N2O par plusieurs étapes et analysé à l’aide de la chromatographie au gaz quadrupole– spectrométrie de masse.
Abstract
L’importance de comprendre le sort du nitrate (NO3−), qui est l’espèce dominante de N transférée des écosystèmes terrestres aux écosystèmes aquatiques, a augmenté parce que les charges mondiales d’azote ont considérablement augmenté à la suite de l’industrialisation. La réduction du nitrate dissimilatoire à l’ammonium (DNRA) et la dénitrification sont deux processus microbiens qui utilisent no3− pour la respiration. Par rapport à la dénitrification, les déterminations quantitatives de l’activité de la DNRA n’ont été effectuées que dans une mesure limitée. Cela a conduit à une compréhension insuffisante de l’importance de la DNRA dans les transformations no3− et des facteurs régulateurs de ce processus. L’objectif du présent document est de fournir une procédure détaillée pour la mesure du taux potentiel de DNRA dans les échantillons environnementaux. En bref, le taux potentiel de DNRA peut être calculé à partir du taux d’accumulation d’ammonium étiqueté 15N (15NH4+) dans 15NO3− incubation ajoutée. La détermination des 14concentrations de NH4+ et 15NH4+ décrites dans le présent document comprend les étapes suivantes. Tout d’abord, le NH4+ dans l’échantillon est extrait et piégé sur un filtre en verre acidifié comme sel d’ammonium. Deuxièmement, l’ammonium piégé est éluturé et oxydé à NO3− par oxydation du persulfate. Troisièmement, le NO3− est converti en N2O via un dénitrificateur déficient en réductase N2O. Enfin, le N2O converti est analysé à l’aide d’un système quadripolaire de spectrométrie par spectrométrie de masse précédemment développé. Nous avons appliqué cette méthode aux sédiments des marais salés et calculé leurs taux potentiels de DNRA, démontrant que les procédures proposées permettent une détermination simple et plus rapide par rapport aux méthodes décrites précédemment.
Introduction
La synthèse artificielle de l’engrais azoté et son application généralisée ont grandement perturbé le cycle mondial de l’azote. On estime que le transfert d’azote réactif des systèmes terrestres vers les systèmes côtiers a doublé depuis l’époque préindustrielle1. Une partie importante des engrais appliqués à un champ donné est emportée du sol vers les rivières ou les eaux souterraines, principalement sous le nomde NO 3− 2. Cela peut causer des problèmes environnementaux tels que la pollution de l’eau potable, l’eutrophisation et la formation d’hypoxie. NO3− dans les milieux aquatiques est retiré ou conservé dans l’écosystème par l’assimilation biologique et divers processus dissimilatoires microbiens. La dénitrification et l’anammox sont connus pour être des processus d’ablation microbienne majeurs pour no3−. La dénitrification est la réduction microbienne du NO3− aux produits gazeux N (NO, N2O et N2)couplée à l’oxydation d’un donneur d’électrons, tels que les substances organiques, réduisant ainsi le risque des problèmes susmentionnés. Anammox produit également N2 à partir de NO2− et NH4+; par conséquent, il élimine le N inorganique d’un écosystème. Inversement, la DNRA travaille à conserver le N dans un écosystème; il est généralement admis que la DNRA est effectuée principalement par des bactéries fermentatives ou des bactéries chimiolithoautotrophiques et qu’elles réduisent le N°3dissimilatoire− à la biodisponibilité et moins mobile NH4+.
Des études sur la DNRA ont été principalement réalisées dans des écosystèmes marins ou estuariens, tels que les sédiments océaniques ou estuariens et l’eau, le sol des marais salés ou saumâtres et le sol des mangroves. Les écosystèmes côtiers ou marins sont importants en tant que réservoirs pour enlever no3− des écosystèmes terrestres, et dans des études précédentes, DNRA a été montré pour contribuer sur un très large éventail de NO3− enlèvement (0–99%)3,4,5,6,7,,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. En outre, l’existence de la DNRA a été démontrée dans un large éventail d’environnements, y compris les milieux d’eau douce19, les sols paddy de riz20, et les sols forestiers21. Bien que ces études aient montré que la DNRA est potentiellement comparable à la dénitrification pour l’élimination du NO3− , les études mesurant l’activité du DNRA sont encore très limitées par rapport à celles mesurant la dénitrification.
Le taux de DNRA a été évalué à l’aide de 15techniques d’étiquetage N en conjonction avec l’analyse des données au moyen de modèles analytiques ou numériques. Une solution analytique pour calculer le taux de DNRA est basée sur l’augmentation de l’enrichissement de 15N du pool NH4+ après l’ajout de 15NO3− comme traceur. 15 N-étiqueté NO3− est ajouté à un échantillon et incubé, et le taux de DNRA peut alors être calculé à partir des variations de concentration et de rapport isotopique dans NH4+ avant et après une certaine période de temps. Dans cet article, une méthode de quantification de la concentration de NH4+ et du rapport isotopique, qui sont nécessaires pour calculer le taux de DNRA, est décrite en détail. Fondamentalement, la méthode rapportée ici est une combinaison de plusieurs techniques précédemment rapportées22,23,24,25,26 avec des modifications ajoutées à certaines procédures. La méthode est composée d’une série de cinq procédures composantes : (1) incubation d’un échantillon environnemental avec modification d’un traceur d’isotopes stables, 15NO3−, (2) extraction et récupération de NH4+ à l’aide d’une « rocédeur de diffusion » avec modifications, (3) oxydation du persulfate de NH4+ dans l’échantillon, composé de NH indigènes4+ et 15NH4+ dérivés de 15NO3− via l’activité DNRA, en N°3− et 15NO3−, (4) transformation microbienne ultérieure de NO3− et 15NO3− à N2O isotopomères par la méthode de dénitrification modifiée, et (5) quantification des isotopomères N2O utilisant la chromatographie gazeuse–spectrométrie de masse (GC/MS). Dans la section suivante, d’abord, la préparation des procédures (2) et (4) est décrite, puis, par la suite, les cinq procédures des composantes sont décrites en détail.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le rapport concentration et isotope du NH4+ pour l’analyse DNRA a été quantifié à l’aide de plusieurs méthodes. Les concentrations et les rapports isotopiques de NH4+ sont généralement mesurés séparément. La concentration de NH4+ est généralement mesurée à l’aide de méthodes colorimétriques, y compris un autoanalyseur4,10,15,<sup c…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Naoto Tanaka d’avoir aidé à la collecte de données et d’avoir développé le protocole. La collecte d’échantillons a été appuyée par le numéro de subvention 17K15286 de JSPS KAKENHI.
Materials
| 15N-KNO3 | SHOKO SCIENCE | N15-0197 | |
| 15N-NH4Cl | SHOKO SCIENCE | N15-0034 | |
| 20 mL PP bottle | SANPLATEC | 61-3210-18 | Wide-mouth |
| Aluminum cap | Maruemu | 1307-13 | No. 20, with hole |
| Boric acid | Wako | 021-02195 | |
| Centrifuge | HITACHI | Himac CR21G II | |
| Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector | SANSIN INDUSTRIAL | IP-12 | |
| Disposable cellulose acetate membrane filter | ADVANTEC | 25CS020AS | Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter |
| Disposable syringe | Termo | SS-10SZ | 10 mL |
| Disposable syringe | Termo | SS-01T | 1 mL |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) | NISSUI PHARMACEUTICAL | 5913 | |
| Gastight syringe | VICI Valco Instruments | 4075-15010 | Series A-2, 100 µL |
| GC/MS | shimadzu | GCMS-QP2010ultra | |
| GF/D | Whatman | 1823-010 | 10 mm in diameter |
| Glass vial | Maruemu | 0501-06 | 20 mL |
| Gray butyl rubber stopper | Maruemu | 1306-03 | No.20-S |
| H2SO4 | Wako | 192-04696 | Guaranteed Reagent |
| K2S2O8 | Wako | 169-11891 | Nitrogen and Phosphorus analysis grade |
| KCl | Wako | 163-03545 | Guaranteed Reagent |
| KNO3 | Wako | 160-04035 | Guaranteed Reagent |
| NaOH | Wako | 191-08625 | Nitrogen compounds analysis grade |
| NH4Cl | Wako | 017-02995 | Guaranteed Reagent |
| Plastic centrifuge tube | ASONE | 1-3500-22 | 50 mL, VIO-50BN |
| Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 13985 | Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens |
| PTFE sealing tape | Sigma-Aldrich | Z221880 | 25 mm in width |
| Reciprocating shaker | TAITEC | 0000207-000 | NR-10 |
| Screw-cap test tube | IWAKI | 84-0252 | 11 mL |
| PTFE-lined cap for test tube | IWAKI | 84-0262 | |
| Tryptic Soy Broth | Difco Laboratories | 211825 |
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