Medição das Taxas Potenciais de Redução de Nitrato Dissimlatório para Amônio Com base em 14NH4+/15NH4+ Análises via Conversão Sequencial para N2O

Summary

Uma série de métodos para determinar a taxa potencial de DNRA com base em ¹⁴NH₄⁺/¹⁵NH₄⁺ análises é fornecida em detalhes. NH₄⁺ é convertido em N₂O através de várias etapas e analisado usando cromatografia de gás quadrupole-espectrometria de massa.

Abstract

A importância de entender o destino do nitrato (NO₃⁻), que é a espécie N dominante transferida de ecossistemas terrestres para aquáticos, tem aumentado porque as cargas globais de nitrogênio aumentaram drasticamente após a industrialização. A redução do nitrato dissimlatório para o amônio (DNRA) e a denitrificação são processos microbianos que usam o NO₃^– para respiração. Em comparação com a denitrificação, as determinações quantitativas da atividade DNRA têm sido realizadas apenas em uma medida limitada. Isso levou a uma compreensão insuficiente da importância do DNRA no Nº₃^– transformações e os fatores reguladores desse processo. O objetivo deste artigo é fornecer um procedimento detalhado para a medição da taxa potencial de DNRA em amostras ambientais. Em suma, a taxa potencial de DNRA pode ser calculada a partir da taxa de acumulação de amônio com rótulo ^{N 15}NH (¹⁵NH₄⁺) em ¹⁵NO₃⁻ incubação adicionada. A determinação das concentrações ¹⁴NH₄⁺ e ¹⁵NH₄⁺ descritas neste artigo é composta pelas etapas a seguir. Primeiro, o NH₄⁺ na amostra é extraído e preso em um filtro de vidro acidificado como sal de amônio. Em segundo lugar, o amônio preso é elucido e oxidado para o Nº₃^– via oxidação persulfeto. Em terceiro lugar, o NO₃⁻ é convertido para N₂O através de um N₂O reductase denitrifier deficiente. Finalmente, o N₂O convertido é analisado usando um sistema de espectrometria de gás quadrúpole previamente desenvolvido. Aplicamos este método aos sedimentos de pântanos salgados e calculamos suas potenciais taxas de DNRA, demonstrando que os procedimentos propostos permitem uma determinação simples e mais rápida em comparação com os métodos descritos anteriormente.

Introduction

A síntese artificial do fertilizante nitrogênio e sua aplicação generalizada têm perturbado muito o ciclo global de nitrogênio. Estima-se que a transferência de nitrogênio reativo de sistemas terrestres para costeiros dobrou desde o pré-industrial¹. Uma porção significativa de fertilizantes aplicados a um determinado campo é levada do solo para rios ou águas subterrâneas, principalmente como nº₃^{− 2}. Isso pode causar problemas ambientais, como a poluição da água potável, a eutrofização e a formação de hipóxia. NO₃⁻ em ambientes hídricos é removido ou retido no ecossistema através de assimilação biológica e vários processos dissimlatórios microbianos. A denitrificação e a anammox são conhecidas por serem os principais processos de remoção microbiana para o NO₃⁻. A denitrificação é a redução microbiana de produtos_N⁻ N gasoso (NO, N₂O e N₂) juntamente com a oxidação de um doador de elétrons, como substâncias orgânicas, reduzindo assim o risco dos problemas acima mencionados. A Anammox também produz N₂ a partir de NO₂⁻ e NH₄⁺; portanto, remove n inorgânico de um ecossistema. Por outro lado, a DNRA trabalha para reter n em um ecossistema; é geralmente aceito que o DNRA é realizado principalmente por bactérias fermentativas ou quimiotoautotróficas e que reduzem o dissimlatório NO₃^– à NH 4⁺₄+ biodisponente e menos móvel.

Estudos sobre DNRA têm sido realizados principalmente em ecossistemas marinhos ou estuarinos, como sedimentos oceânicos ou estuarinos e água, solo salgado ou salgado e solo de manguezal. Ecossistemas costeiros ou marinhos são importantes como reservatórios para a remoção do Nº₃^– dos ecossistemas terrestres, e em estudos anteriores o DNRA tem se mostrado contribuinte em uma gama muito ampla de NO₃⁻ remoção (0-99%)^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18}. Além disso, a existência do DNRA tem sido demonstrada em uma ampla gama de ambientes, incluindo ambientes de água doce^19,solos de arroz²⁰e solos^{florestais 21}. Embora esses estudos tenham demonstrado que o DNRA é potencialmente comparável à denitrificação para o NO₃⁻ remoção, os estudos que medem a atividade de DNRA ainda são muito limitados em comparação com aqueles que medem a denitrificação.

A taxa de DNRA foi avaliada ^{utilizando-se 15}técnicas de rotulagem N em conjunto com a análise de dados por meio de modelos analíticos ou numéricos. Uma solução analítica para calcular a taxa DNRA baseia-se no aumento do enriquecimento de ¹⁵N do pool NH₄⁺ após a adição de ¹⁵NO₃⁻ como rastreador. ¹⁵ N-rotulado NO₃⁻ é adicionado a uma amostra e incubado, e a taxa de DNRA pode então ser calculada a partir da concentração e da razão isótopo alterações na NH₄⁺ antes e depois de um determinado período de tempo. Neste artigo, um método para quantificar a concentração NH₄⁺ e a razão isótopos, que são necessários para calcular a taxa de DNRA, é descrito em detalhes. Basicamente, o método aqui relatado é uma combinação de várias técnicas relatadas anteriormente^{22,23,24,25,26} com modificações adicionadas a alguns procedimentos. O método é composto por uma série de cinco procedimentos componentes: (1) incubação de uma amostra ambiental com a alteração de um rastreador de isótopos estáveis, ¹⁵NO₃⁻, (2) extração e recuperação de NH₄⁺ utilizando um “procedimento de difusão” com modificações, (3) oxidação persulfato de NH₄⁺ na amostra, constituído por NH₄⁺ e ¹⁵NH₄⁺ derivados de ¹⁵NO₃⁻ via atividade DNRA, em NO₃⁻ e ¹⁵NO₃⁻, (4) posterior transformação microbiana de NO₃⁻ e ^{1 5}NO₃⁻ para N₂O isotopomers através do método denitrifier modificado, e (5) quantificação dos isotopolímeros N₂O usando cromatografia a gás espectrometria de massa (GC/MS). Na seção seguinte, primeiro, a preparação para procedimentos (2) e (4) é descrita e, posteriormente, todos os cinco procedimentos componentes são descritos detalhadamente.

Protocol

1. Preparação de um envelope PTFE para captura quantitativa de NHgasoso 3 Coloque uma peça de 60 mm de fita politetrafluoroetileno (PTFE) (25 mm de largura) em uma pequena folha de papel alumínio (aproximadamente 300 mm x 450 mm de tamanho, limpa com etanol). Ash um filtro de fibra de vidro (10 mm de diâmetro com um tamanho de poros de 2,7 μm) a 450 °C por 4h em um forno de abafa. Coloque o filtro de fibra de vidro um pouco acima do ponto médio do eixo mais longo da fita<strong clas…

Representative Results

Os resultados representativos apresentados neste artigo foram derivados de 15experimentos de rastreamento n de sedimentos de pântanos salgados. O pântano de sal amostrado foi recentemente criado após o Grande Terremoto do Japão Oriental de 2011 na área de Moune da cidade de Kesen-numa, na província de Miyagi, japão. Em setembro de 2017, sedimentos superficiais (0-3 cm) foram coletados em dois locais nas zonas subtidal e intertidais. Primeiro, logo após a coleta, o sedim…

Discussion

A razão de concentração e isótopo de NH₄⁺ para a análise DNRA foi quantificada utilizando vários métodos. As concentrações e as relações de isótopos de NH₄⁺ são geralmente medidas separadamente. A concentração NH₄⁺ é tipicamente medida usando métodos colorimétricos, incluindo um autoanalyzer^{4,10,15,16,</sup…}

Materials

15N-KNO3	SHOKO SCIENCE	N15-0197
15N-NH4Cl	SHOKO SCIENCE	N15-0034
20 mL PP bottle	SANPLATEC	61-3210-18	Wide-mouth
Aluminum cap	Maruemu	1307-13	No. 20, with hole
Boric acid	Wako	021-02195
Centrifuge	HITACHI	Himac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector	SANSIN INDUSTRIAL	IP-12
Disposable cellulose acetate membrane filter	ADVANTEC	25CS020AS	Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringe	Termo	SS-10SZ	10 mL
Disposable syringe	Termo	SS-01T	1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-)	NISSUI PHARMACEUTICAL	5913
Gastight syringe	VICI Valco Instruments	4075-15010	Series A-2, 100 µL
GC/MS	shimadzu	GCMS-QP2010ultra
GF/D	Whatman	1823-010	10 mm in diameter
Glass vial	Maruemu	0501-06	20 mL
Gray butyl rubber stopper	Maruemu	1306-03	No.20-S
H2SO4	Wako	192-04696	Guaranteed Reagent
K2S2O8	Wako	169-11891	Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KCl	Wako	163-03545	Guaranteed Reagent
KNO3	Wako	160-04035	Guaranteed Reagent
NaOH	Wako	191-08625	Nitrogen compounds analysis grade
NH4Cl	Wako	017-02995	Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tube	ASONE	1-3500-22	50 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 13985	Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tape	Sigma-Aldrich	Z221880	25 mm in width
Reciprocating shaker	TAITEC	0000207-000	NR-10
Screw-cap test tube	IWAKI	84-0252	11 mL
PTFE-lined cap for test tube	IWAKI	84-0262
Tryptic Soy Broth	Difco Laboratories	211825