Misurazione dei tassi potenziali di riduzione del nitrato dissimiliva all'ammonio sulla base di 14NH4/15NH4- Analisi tramite conversione sequenziale in N2O
Summary
Viene fornita in dettaglio una serie di metodi per determinare il tasso potenziale di DNRA basato+ su 14NH4/15NH4. L’NH 4viene convertito in N2O attraverso diversi passaggi e analizzato utilizzando la cromatografia a gas quadrupole- spettrometria di massa.
Abstract
L’importanza di comprendere il destino del nitrato (NO3–), che è la specie dominante N trasferita dagli ecosistemi terrestri a quello acquatico, è aumentata perché i carichi globali di azoto sono aumentati drammaticamente dopo l’industrializzazione. La riduzione del nitrato dissimile all’ammonio (DNRA) e la denitrificazione sono entrambi processi microbici che utilizzano NO3per la respirazione. Rispetto alla denitrificazione, le determinazioni quantitative dell’attività dell’ANRA sono state effettuate solo in misura limitata. Ciò ha portato a una comprensione insufficiente dell’importanza del DNRA nelle trasformazioni NO3− e dei fattori di regolazione di questo processo. L’obiettivo di questo documento è quello di fornire una procedura dettagliata per la misurazione del potenziale tasso di DNRA nei campioni ambientali. In breve, il tasso potenziale di DNRA può essere calcolato a partire dal tasso di accumulo di ammonio 15N –15NH4–de 15NO3– incubazione aggiunta. La determinazione delle concentrazioni 14NH4e 15NH4 , descritte in questo documento, comprende le seguenti fasi. In primo luogo,l’NH 4nel campione viene estratto e intrappolato su un filtro di vetro acidificato come sale di ammonio. In secondo luogo, l’ammonio intrappolato viene elizzato e ossidato a NO3– tramite ossidazione persulfata. In terzo luogo, il NO3– viene convertito in N2O tramite un denitrifier N2O. Infine, il N2O convertito viene analizzato utilizzando un sistema di spettrometria di gas quadrupolo-massa precedentemente sviluppato. Abbiamo applicato questo metodo ai sedimenti delle paludi salate e calcolato i loro potenziali tassi di DNRA, dimostrando che le procedure proposte consentono una determinazione semplice e più rapida rispetto ai metodi descritti in precedenza.
Introduction
La sintesi artificiale del fertilizzante azotato e la sua applicazione diffusa hanno notevolmente perturbato il ciclo globale dell’azoto. Si stima che il trasferimento di azoto reattivo dai sistemi terrestri ai sistemi costieri sia raddoppiato dai tempi preindustriali1. Una porzione significativa di fertilizzanti applicati a un determinato campo viene lavata via dal suolo ai fiumi o alle acque sotterranee, principalmente come NO3– 2. Ciò può causare problemi ambientali come l’inquinamento dell’acqua potabile, l’eutrofazione e la formazione di ipossia. NO3– in ambienti idrici viene rimosso o mantenuto nell’ecosistema tramite assimilazione biologica e vari processi dissimilivi microbici. Denitrificazione e anammox sono noti per essere i principali processi di rimozione microbica per NO3. La denitrificazione è la riduzione microbica di NO3– a prodotti gassosi N (NO, N2O e N2) accoppiata con l’ossidazione di un donatore di elettroni, come le sostanze organiche, riducendo così il rischio dei problemi di cui sopra. Anammox produce anche N2 da NO2e NH4; pertanto, rimuove n inorganico da un ecosistema. Al contrario, DNRA lavora per mantenere N in un ecosistema; è generalmente accettato che il DNRA sia eseguito principalmente da batteri fermentanti o chemiolithoautotrofici e che riducano la dissimiltoria NO3– a NH4biodisponibile e meno mobile .+
Studi sul DNRA sono stati condotti principalmente in ecosistemi marini o estuari, come sedimenti oceanici o estuari e acqua, sale o terreno paludoso sal brasato e suolo di mangrovie. Gli ecosistemi costieri o marini sono importanti in quanto i serbatoi per la rimozionedel NO3dagli ecosistemi terrestri, e in studi precedenti DNRA ha dimostrato di contribuire su una gamma molto ampia di NO3–rimozione (0-99%)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Inoltre, l’esistenza di DNRA è stata dimostrata in una vasta gamma di ambienti tra cui ambientid’acqua dolce 19, risaie20e terreniforestali 21. Mentre questi studi hanno dimostrato che il DNRA è potenzialmente paragonabile alla denitrificazione per la rimozione di NO3,− gli studi che misurano l’attività del DNRA sono ancora molto limitati rispetto a quelli che misurano la denitrificazione.
Il tasso DNRA è stato valutato utilizzando 15tecniche di etichettatura N in combinazione con l’analisi dei dati tramite modelli analitici o numerici. Una soluzione analitica per calcolare il tasso di DNRA si basa sull’aumento dell’arricchimento 15N del pool NH4dopo l’aggiunta di 15NO3– come tracciante. 15 anni Il N-labeled NO3– viene aggiunto a un campione e incubato, e il tasso DNRA può quindi essere calcolato in base alle variazioni del rapporto di concentrazione e isotopo in NH4– prima e dopo un certo periodo di tempo. In questo documento, viene descritto in dettaglio un metodo per quantificarela concentrazione NH 4+ e il rapporto isotopi, necessari per calcolare il tasso DNRA. Fondamentalmente, il metodo riportato qui è una combinazione di diverse tecniche precedentemente riportate22,23,24,25,26 con modifiche aggiunte ad alcune procedure. Il metodo è costituito da una serie di cinque procedure componenti: (1) l’incubazione di un campione ambientale con la modifica di un tracciante isotopo stabile, 15NO3,(2) l’estrazione e il recupero di NH4+ , utilizzando una “procedura di diffusione” con modifiche, (3) persulfare l’ossidazione di NH4– nel campione, costituito da indigeni NH4e 15NH4– derivati da 15NO3– tramite attività DNRA, in NO3– e 15NO3,(4) successiva trasformazione microbica di NO3− e 3 15NO3– a N2O isotopomers tramite il metodo denitrifier modificato, e (5) la quantificazione degli isotopomi N2O utilizzando la cromatografia gassosa-spettrometria di massa (GC/MS).+ Nella sezione seguente, in primo luogo, viene descritta la preparazione per le procedure (2) e (4) e successivamente, tutte e cinque le procedure dei componenti sono descritte in dettaglio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il rapporto di concentrazione e isotopo di NH4per l’analisi DNRA è stato quantificato utilizzando diversi metodi. Le concentrazioni e i rapporti isotopi di NH4sono generalmente misurati separatamente. La concentrazione NH4è in genere misurata utilizzando metodi colorimetrici tra cui un autoanalyzer4,10,15,16,<sup cla…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Naoto Tanaka per aver aiutato la raccolta dei dati e lo sviluppo del protocollo. La raccolta di campioni è stata supportata da JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286.
Materials
| 15N-KNO3 | SHOKO SCIENCE | N15-0197 | |
| 15N-NH4Cl | SHOKO SCIENCE | N15-0034 | |
| 20 mL PP bottle | SANPLATEC | 61-3210-18 | Wide-mouth |
| Aluminum cap | Maruemu | 1307-13 | No. 20, with hole |
| Boric acid | Wako | 021-02195 | |
| Centrifuge | HITACHI | Himac CR21G II | |
| Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector | SANSIN INDUSTRIAL | IP-12 | |
| Disposable cellulose acetate membrane filter | ADVANTEC | 25CS020AS | Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter |
| Disposable syringe | Termo | SS-10SZ | 10 mL |
| Disposable syringe | Termo | SS-01T | 1 mL |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) | NISSUI PHARMACEUTICAL | 5913 | |
| Gastight syringe | VICI Valco Instruments | 4075-15010 | Series A-2, 100 µL |
| GC/MS | shimadzu | GCMS-QP2010ultra | |
| GF/D | Whatman | 1823-010 | 10 mm in diameter |
| Glass vial | Maruemu | 0501-06 | 20 mL |
| Gray butyl rubber stopper | Maruemu | 1306-03 | No.20-S |
| H2SO4 | Wako | 192-04696 | Guaranteed Reagent |
| K2S2O8 | Wako | 169-11891 | Nitrogen and Phosphorus analysis grade |
| KCl | Wako | 163-03545 | Guaranteed Reagent |
| KNO3 | Wako | 160-04035 | Guaranteed Reagent |
| NaOH | Wako | 191-08625 | Nitrogen compounds analysis grade |
| NH4Cl | Wako | 017-02995 | Guaranteed Reagent |
| Plastic centrifuge tube | ASONE | 1-3500-22 | 50 mL, VIO-50BN |
| Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 13985 | Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens |
| PTFE sealing tape | Sigma-Aldrich | Z221880 | 25 mm in width |
| Reciprocating shaker | TAITEC | 0000207-000 | NR-10 |
| Screw-cap test tube | IWAKI | 84-0252 | 11 mL |
| PTFE-lined cap for test tube | IWAKI | 84-0262 | |
| Tryptic Soy Broth | Difco Laboratories | 211825 |
Referencias
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