Medición de las tasas potenciales de reducción de nitrato disimilado a amonio basada en 14NH4+/15NH4+ Análisis a través de la conversión secuencial a N2O

Summary

Se proporciona en detalle una serie de métodos para determinar la tasa potencial de DNRA basada en ¹⁴análisis NH₄+^/15NH₄^+. NH₄⁺ se convierte en N₂O a través de varios pasos y se analiza utilizando cromatografía de gases cuadrúpedos-espectrometría de masas.

Abstract

La importancia de entender el destino del nitrato (NO_3o),⁻que es la especie N dominante transferida de los ecosistemas terrestres a los acuáticos, ha ido aumentando porque las cargas mundiales de nitrógeno han aumentado drásticamente tras la industrialización. La reducción disimilizante de nitratos a amonio (DNRA) y la desnitrificación son procesos microbianos que utilizan NO₃^para la respiración. En comparación con la desnitrificación, las determinaciones cuantitativas de la actividad de la DNRA se han llevado a cabo sólo en una medida limitada. Esto ha llevado a una comprensión insuficiente de la importancia de DNRA en^las transformaciones NO₃y los factores reguladores de este proceso. El objetivo de este documento es proporcionar un procedimiento detallado para la medición de la tasa potencial de DNRA en muestras ambientales. En resumen, la tasa potencial de DNRA se puede calcular a partir de la tasa de acumulación de amonio con etiqueta N de ¹⁵(¹⁵NH₄⁺) en ¹⁵NO₃^– incubación añadida. La determinación de las ¹⁴concentraciones NH₄⁺ y ¹⁵NH₄⁺ descritas en este documento se compone de los siguientes pasos. En primer lugar, el NH₄⁺ en la muestra se extrae y se atrapa en un filtro de vidrio acidificado como sal de amonio. En segundo lugar, el amonio atrapado se elue y se oxida a NO₃a través^de la oxidación del persulfato. En tercer lugar, el NO₃^se convierte en N₂O a través de un denitrificador de deficiencia de N₂O reductasa. Finalmente, el N₂O convertido se analiza utilizando un sistema de cromatografía de gases de cuadrúpedo-espectrometría de masas previamente desarrollado. Aplicamos este método a los sedimentos de marismas y calculamos sus tasas potenciales de DNRA, demostrando que los procedimientos propuestos permiten una determinación simple y más rápida en comparación con los métodos descritos anteriormente.

Introduction

La síntesis artificial de fertilizantes nitrogenados y su aplicación generalizada han perturbado enormemente el ciclo global del nitrógeno. Se estima que la transferencia de nitrógeno reactivo de los sistemas terrestres a los costeros se ha duplicado desde tiempos preindustriales¹. Una porción significativa de los fertilizantes aplicados a un campo determinado se lava lejos del suelo a los ríos o aguas subterráneas, principalmente como NO₃^{a 2}. Esto puede causar problemas ambientales como la contaminación del agua potable, la eutrofización y la formación de hipoxia. NO₃^es ambientes de agua se elimina o se retiene en el ecosistema a través de la asimilación biológica y varios procesos de disimilación microbiana. Se sabe que la desnitrificación y el anammox son los principales procesos de eliminación microbiana para NO_3.⁻ La desnitrificación es la reducción microbiana de NO₃^a los productos N gaseosos (NO, N₂O y N₂₎junto con la oxidación de un donante de electrones, como las sustancias orgánicas, reduciendo así el riesgo de los problemas antes mencionados. Anammox también produce N₂ a partir de NO_2o⁻ y NH₄⁺; por lo tanto, elimina N inorgánico de un ecosistema. Por el contrario, DNRA trabaja para retener N en un ecosistema; generalmente se acepta que DNRA se realiza principalmente por bacterias fermentativas o bacterias quimiolitoautotróficas y que reducen el disimilario NO₃^a BIOdisponible y menos móvil NH₄⁺.

Los estudios sobre DNRA se han realizado principalmente en ecosistemas marinos o estuarinas, como sedimentos oceánicos o estuarinas y agua, tierra de marisma sal o salobre, y suelo de manglar. Los ecosistemas costeros o marinos son importantes como reservorios para eliminar NO₃^de los ecosistemas terrestres, y en estudios anteriores se ha demostrado que DNRA contribuye en una gama muy amplia de^eliminación de NO₃(0-99%)^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,,15,16,17,18}.¹⁴ Además, la existencia de DNRA se ha demostrado en una amplia gama de ambientes, incluyendo ambientes de agua dulce^19,suelos de arroz^20,y suelos forestales^21. Si bien estos estudios han demostrado que DNRA es potencialmente comparable a la desnitrificación para la^eliminación de NO_3,los estudios que miden la actividad de DNRA son todavía muy limitados en comparación con los que miden la desnitrificación.

La tasa DNRA se ha evaluado utilizando ¹⁵técnicas de etiquetado N junto con el análisis de datos a través de modelos analíticos o numéricos. Una solución analítica para calcular la tasa DNRA se basa en el aumento en el enriquecimiento de ¹⁵N de la piscina NH₄⁺ después de la adición de ¹⁵NO₃^como trazador. ¹⁵ Se añade N-etiqueta no₃⁻ a una muestra e incubada, y la tasa de DNRA se puede calcular a partir de los cambios en la concentración y la relación de isótopos en NH₄⁺ antes y después de un cierto período de tiempo. En este artículo, se describe en detalle un método para cuantificar la concentración NH₄⁺ y la relación de isótopos, que se requieren para calcular la tasa DNRA. Básicamente, el método reportado aquí es una combinación de varias técnicas previamente reportadas^{22,23,24,25,26} con modificaciones añadidas a algunos procedimientos. El método se compone de una serie de cinco procedimientos componentes: (1) incubación de una muestra ambiental con la modificación de un trazador de isótopos estable, ¹⁵NO_3o,⁻(2) extracción y recuperación de NH₄⁺ utilizando un “procedimiento de difusión” con modificaciones, (3) oxidación de persulfato de NH₄⁺ en la muestra, que consiste en los indígenas NH₄⁺ y ¹⁵NH₄⁺ derivados de ¹⁵NO₃^a través de la actividad DNRA, en NO_3o⁻ y ¹⁵NO_3o,⁻(4) transformación microbiana posterior de NO_3o⁻ y ¹⁵isótopómeros NO₃^a N₂O mediante el método desnitrificador modificado y (5) cuantificación de los isótopómeros N₂O utilizando cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC/MS). En la siguiente sección, en primer lugar, se describe la preparación para los procedimientos (2) y (4) y, posteriormente, se describen detalladamente los cinco procedimientos de componentes.

Protocol

1. Preparación de una envolvente de PTFE para capturar cuantitativamente los gases NH3 Coloque una pieza de 60 mm de cinta de politetrafluoroetileno (PTFE) (25 mm de ancho) en una pequeña lámina de aluminio (aproximadamente 300 mm x 450 mm de tamaño, limpiada con etanol). Ceniza de un filtro de fibra de vidrio (10 mm de diámetro con un tamaño de poro de 2,7 m) a 450 oC durante 4 h en un horno de mufla. Coloque el filtro de fibra de vidrio un poco por encima del punto medio del eje má…

Representative Results

Los resultados representativos presentados en este documento se derivaron de 15experimentos de rastro de N de sedimentos de marismas. La marisma muestreada fue creada recientemente después del Gran Terremoto del Este de Japón de 2011 en el área de Moune de la ciudad de Kesen-numa en la prefectura de Miyagi, Japón. En septiembre de 2017, se recogieron sedimentos superficiales (0-3 cm) en dos emplazamientos en las zonas submareales e intermareales. Primero, inmediatamente des…

Discussion

La concentración y la relación de isótopos de NH₄⁺ para el análisis DNRA se cuantificaron utilizando varios métodos. Las concentraciones y las relaciones de isótopos de NH₄⁺ generalmente se miden por separado. La concentración de NH₄⁺ se mide típicamente utilizando métodos colorimétricos incluyendo un autoanalyzer^{4,10,15,16</…}

Materials

15N-KNO3	SHOKO SCIENCE	N15-0197
15N-NH4Cl	SHOKO SCIENCE	N15-0034
20 mL PP bottle	SANPLATEC	61-3210-18	Wide-mouth
Aluminum cap	Maruemu	1307-13	No. 20, with hole
Boric acid	Wako	021-02195
Centrifuge	HITACHI	Himac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector	SANSIN INDUSTRIAL	IP-12
Disposable cellulose acetate membrane filter	ADVANTEC	25CS020AS	Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringe	Termo	SS-10SZ	10 mL
Disposable syringe	Termo	SS-01T	1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-)	NISSUI PHARMACEUTICAL	5913
Gastight syringe	VICI Valco Instruments	4075-15010	Series A-2, 100 µL
GC/MS	shimadzu	GCMS-QP2010ultra
GF/D	Whatman	1823-010	10 mm in diameter
Glass vial	Maruemu	0501-06	20 mL
Gray butyl rubber stopper	Maruemu	1306-03	No.20-S
H2SO4	Wako	192-04696	Guaranteed Reagent
K2S2O8	Wako	169-11891	Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KCl	Wako	163-03545	Guaranteed Reagent
KNO3	Wako	160-04035	Guaranteed Reagent
NaOH	Wako	191-08625	Nitrogen compounds analysis grade
NH4Cl	Wako	017-02995	Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tube	ASONE	1-3500-22	50 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 13985	Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tape	Sigma-Aldrich	Z221880	25 mm in width
Reciprocating shaker	TAITEC	0000207-000	NR-10
Screw-cap test tube	IWAKI	84-0252	11 mL
PTFE-lined cap for test tube	IWAKI	84-0262
Tryptic Soy Broth	Difco Laboratories	211825