منصة مختبر علي القرص المضغوط لتوليد خزان ثلاثي الابعاد متعدد الخلايا
Summary
نقدم جهاز ميكروفلويديك الطرد المركزي التي تعمل بالمحركات التي يمكن ان تزرع الخلايا خزان. باستخدام هذا الجهاز ، يمكن لخزان من أنواع الخلايا المفردة أو المتعددة ان تكون بسهوله الخياطة تحت ظروف الجاذبية العالية.
Abstract
ثقافة خليه كروي ثلاثية الابعاد يمكن الحصول علي نتائج أكثر فائده في تجارب الخلايا لأنها يمكن ان تحاكي أفضل البيئات المجهرية الخلية من الجسم الحي من ثقافة الخلية ثنائيه الابعاد. في هذه الدراسة ، ونحن ملفقه الكهربائية يحركها المحرك مختبر علي a-CD (القرص المضغوط) منصة ، ودعا الطرد المركزي القائم علي كروي (CMS) نظام الثقافة ، لخلق ثلاثي الابعاد (3D) خليه خزان تنفيذ قوه الطرد المركزي عاليه. هذا الجهاز يمكن ان تختلف سرعات الدوران لتوليد ظروف الجاذبية من 1 × g إلى 521 x g. نظام CMS هو 6 سم في القطر ، لديه 500 μm ميكروويلس ، ويرصد من قبل صب مع polydimethylsiloxane في قالب البولي التي premade جهاز الكمبيوتر الرقمية التحكم. جدار حاجز عند مدخل القناة لنظام CMS يستخدم قوه الطرد المركزي لنشر الخلايا بالتساوي داخل رقاقه. في نهاية القناة ، توجد منطقه منزلقه تسمح للخلايا بدخول الميكروويلس. وكمظاهره ، تولدت خزان بالزراعة الاحاديه وزراعه الخلايا الجذعية المستمدة من الدهون البشرية والورم الليفي بالرئة البشرية تحت ظروف الجاذبية العالية باستخدام النظام. استخدم نظام CMS عمليه بسيطه لإنتاج خزان الزراعة من مختلف الهياكل المتمركزة ، يانوس ، وساندويتش. سيكون نظام CMS مفيدا في البيولوجيا الخلوية ودراسات هندسه الانسجه التي تتطلب خزان والثقافة العضوية لأنواع الخلايا المفردة أو المتعددة.
Introduction
فمن الأسهل لمحاكاة البيولوجية في البيئات المجهرية المجرية مع ثلاثي الابعاد (3D) ثقافة الخلية كروي من مع ثقافة الخلية ثنائي الابعاد (2D) (علي سبيل المثال ، التقليدية الثقافة الخلية طبق بيتري) لإنتاج التجريبية أكثر واقعيه من الناحية الفسيولوجية النتائج1. وتشمل الأساليب المتاحة حاليا كروي تشكيل الشنق تقنيه قطره2، تقنيه تراكب السائل3، تقنيه الكربوكسيل ميثيل السليلوز4، المغناطيسية المستندة إلى القوه ميكروفلويديك تقنيه5، واستخدام المفاعلات الحيوية6. علي الرغم من ان كل أسلوب له فوائده الخاصة ، والمزيد من التحسن في استنساخ ، والانتاجيه ، وتوليد خزان الزراعة ضروري. علي سبيل المثال ، في حين ان تقنيه ميكروفلويديك المستندة إلى القوه المغناطيسية5 غير مكلفه نسبيا ، يجب النظر بعناية في اثار المجالات المغناطيسية القوية علي الخلايا الحية. وقد تم الإبلاغ عن فوائد الثقافة الكروية ، ولا سيما في دراسة تمايز الخلايا الجذعية وانتشارها في العديد من الدراسات7و8و9.
نظام ميكروفلويديك الطرد المركزي ، والمعروف أيضا باسم مختبر علي a-CD (القرص المضغوط) ، مفيد للسيطرة بسهوله داخل السائل واستغلال دوران الركيزة ، التالي تم استخدامها في التطبيقات الطبية الحيوية مثل الاختبارات المناعية10، الاختبارات اللونية للكشف عن علامات البيوكيميائية11، تضخيم الحمض النووي (PCR) المقايسات ، ونظم تحليل الدم الألى12، والكل في واحد الطرد المركزي الاجهزه ميكروفلويديك13. القوه الدافعة للسيطرة علي السائل هي قوه الجاذبية التي تم إنشاؤها بواسطة التناوب. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن القيام بوظائف متعددة للخلط ، والاختلاط ، وتقسيم العينات ببساطه في هذا النظام الأساسي لقرص مضغوط واحد. ومع ذلك ، بالمقارنة مع أساليب التحليل البيوكيميائية المذكورة أعلاه ، كان هناك عدد اقل من التجارب التي تطبق منصات القرص المضغوط علي خلايا الثقافة ، وخاصه خزان14.
في هذه الدراسة ، ونحن نظهر أداء نظام الطرد المركزي القائم علي microfluidic كروي (CMS) من الزراعة الاحاديه أو زراعه الخلايا الجذعية المستمدة من الدهون البشرية (hASC) والورم الليفي الرئوي البشري (مومباسا-5). تصف هذه الورقة بالتفصيل المنهجية البحثية لمجموعتنا15. التالي ، فان الثقافة الكروية علي منصة مختبر علي a-CD يمكن بسهوله استنساخها. ويعرض نظام لتوليد CMS يضم رقاقه ثقافة CMS ، حامل رقاقه ، محرك DC ، جبل المحرك ، ومنصة الدورية. المحرك جبل 3D المطبوعة مع اكريلونيتريل البيوتادين (ABS). حامل رقاقه ومنصة الدورية هي CNC (الكمبيوتر التحكم العددي) تشكيله مع جهاز الكمبيوتر (البولي). يتم التحكم في سرعه دوران المحرك من 200 إلى 4,500 لفه في الدقيقة عن طريق ترميز خوارزميه PID (التناسبية المتكاملة) استنادا إلى تعديل عرض النبض. ابعادها هي 100 مم × 100 مم × 150 ملم ويزن 860 غرام ، مما يجعل من السهل التعامل معها. باستخدام نظام CMS ، يمكن ان تتولد خزان تحت ظروف الجاذبية المختلفة من 1 × ز إلى 521 x ز، التالي فان دراسة تعزيز التمايز الخلية تحت الجاذبية العالية يمكن تمديدها من الخلايا 2d16،17 إلى 3d كروي. الزراعة من أنواع مختلفه من الخلايا هو أيضا التكنولوجيا الرئيسية لمحاكاة بشكل فعال في بيئة الجسم الحيوي18. نظام CMS يمكن بسهوله توليد خزان الزراعة الاحاديه ، فضلا عن خزان الزراعة من أنواع مختلفه من الهيكل (علي سبيل المثال ، المتمركزة ، يانوس ، وساندويتش). ويمكن استخدام نظام CMS ليس فقط في دراسات كروي بسيطه ولكن أيضا في دراسات organoid 3D ، للنظر في هياكل الجهاز البشري.
Protocol
Representative Results
Discussion
و CMS هو نظام مغلقه فيها جميع الخلايا المحقونة دخول microwell دون النفايات ، مما يجعلها أكثر كفاءه واقتصادا من الأساليب التقليدية الكروية الجيل الصغرى. في نظام CMS ، يتم استبدال وسائل الاعلام كل 12-24 ساعة من خلال ثقب شفط مصممه لأزاله وسائل الاعلام في رقاقه (الشكل 3A). خلال عمليه شفط و?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث العلمية الاساسيه (2016R1D1A1B03934418) وبرنامج تطوير التكنولوجيا الطبية & البيولوجية (2018M3A9H1023141) من الحكومة الكورية الجنوبية ، والتي تمول من قبل وزاره الدولة ، MSIT.
Materials
| 3D printer | Cubicon | 3DP-210F | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) | ATCC | PCS-500-011 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Contained 1% of completed medium and buffer |
| CellTracker Green CMFDA | Thermo Fisher Scientific | C2925 | 10 mM |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 10 mM |
| Computer numerical control (CNC) rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| DC motor | Nurielectricity Inc. | MB-4385E | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | Contained 10% of completed medium |
| human lung fibroblasts (MRC-5) | ATCC | CCL-171 | |
| Inventor 2019 | Autodesk | 3D computer-aided design program | |
| Petri dish Φ 150 mm | JetBiofill | CAD010150 | Surface Treated |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 11/6/9003 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Polycarbonate (PC) | Acrylmall | AC15PC | 200 x 200 x 15 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Trypsin | Gibco | 12604021 |
Referencias
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Investigación sobre el cáncer. 41 (7), 2980-2984 (1981).
- Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).
- Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
- Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).
- Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).
- Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
- Park, Y. -. S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).
- Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).
- Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).
- Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9 (4), (2017).
- Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
- Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
