多細胞三次元回転楕円体を生成するためのラボオンCDプラットフォーム
Summary
細胞回転楕円体を培養できるモータ駆動遠心マイクロ流体装置を紹介する。この装置を使用して、単一または複数の細胞タイプの回転楕円体は、高い重力条件下で容易に共培養することができる。
Abstract
三次元回転楕円体細胞培養は、2次元細胞培養よりも生体の細胞微小環境をより良くシミュレートできるため、細胞実験でより有用な結果を得ることができる。本研究では、遠心マイクロ流体ベースの回転楕円体(CMS)培養システムと呼ばれる電気モータ駆動ラボオンCD(コンパクトディスク)プラットフォームを作製し、高遠心力を実装する三次元(3D)細胞回転楕円体を作製した。この装置は1 x gから521 x gに重力条件を生成するために回転速度を変えることができる。CMSシステムは直径6cmで、100400μmのマイクロウェルを有し、コンピュータ数値制御機によって予め作られたポリカーボネート型でポリジメチルシロキサンで成形することによって作られています。CMSシステムのチャネル入り口のバリアウォールは、遠心力を使用してチップ内に均等に細胞を広げます。チャネルの終わりに、細胞がマイクロウェルに入ることを可能にするスライド領域があります。デモンストレーションとして、スフェロイドは、システムを用いた高重力条件下でヒト脂肪由来幹細胞およびヒト肺線維芽細胞の単一培養および共培養によって生成された。CMSシステムは、単純な操作スキームを使用して、同心円、ヤヌス、およびサンドイッチの様々な構造の共培養回転楕円体を生成しました。CMSシステムは、単一または複数の細胞型のスフェロイドおよびオルガノイド培養を必要とする細胞生物学および組織工学研究に有用であろう。
Introduction
2次元(2D)細胞培養(例えば、従来のペトリ皿細胞培養)よりも3次元(3D)スフェロイド細胞培養で生体内の微小環境で生物学的なシミュレーションを行い、より生理学的に現実的な実験を行う方が簡単です。結果1.現在入手可能な回転楕円体形成方法には、吊り下げ滴法2、液体オーバーレイ技術3、カルボキシメチルセルロース技術4、磁力系マイクロ流体技術5、及びバイオリアクター6.それぞれの方法には独自の利点がありますが、再現性、生産性、および共培養スフェロイドの生成のさらなる改善が必要です。例えば、磁力系マイクロ流体技術5は比較的安価であるが、強磁場が生細胞に及ぼす影響は慎重に検討しなければならない。回転楕円体培養の利点は、特に間葉系幹細胞分化および増殖の研究において、いくつかの研究において報告されている7、8、9である。
集光マイクロ流体システムは、ラボオンCD(コンパクトディスク)とも呼ばれ、内部の流体を容易に制御し、基板の回転を利用するのに有用であり、従って免疫測定法10などの生物医学的用途に利用されてきた。生化学的マーカー11を検出するための比色アッセイ、核酸増幅(PCR)アッセイ、自動血液分析システム12、およびオールインワン遠心マイクロ流体デバイス13。流体を制御する駆動力は、回転によって作成される引力です。さらに、混合、評価、およびサンプル分割の複数の機能は、この単一の CD プラットフォームで簡単に行うことができます。しかしながら、上記の生化学的分析方法と比較して、培養細胞、特にスフェロイド14にCDプラットフォームを適用する試験は少なくなっている。
本研究では、ヒト脂肪由来幹細胞(hASC)及びヒト肺線維芽細胞(MRC-5)の単一培養又は共培養による遠心微流体系回転楕円体(CMS)系の性能を示す。本論文では、当社グループの研究方法論15について詳しく述べている。これにより、スフェロイド培養ラボオンCDプラットフォームを容易に再現することができる。CMSカルチャーチップ、チップホルダー、DCモータ、モータマウント、回転プラットフォームを備えたCMS生成システムを提示します。モーターマウントは、アクリロニトリルブタジエンスチレン(ABS)で3Dプリントされています。チップホルダーと回転プラットフォームは、PC(ポリカーボネート)で加工されたCNC(コンピュータ数値制御)です。モータの回転数は、パルス幅変調に基づいてPID(比例積分微分)アルゴリズムを符号化することにより、200~4,500rpmを制御します。寸法は100mm×100mm×150mmで、重さは860gで取り扱いが容易です。CMSシステムを使用すると、スフェロイドは1 x gから521 x gまでの様々な重力条件下で生成できるため、高重力下での細胞分化促進の研究を2D細胞16、17から3Dに拡張することができます。回転 楕円 体。種々の種類の細胞の共培養も、生体内環境18を効果的に模倣するための重要な技術である。CMSシステムは、様々な構造タイプ(同心円、ヤヌス、サンドイッチなど)の共培養スフェロイドだけでなく、単一培養スフェロイドを簡単に生成することができます。CMSシステムは、単純な回転楕円体研究だけでなく、3Dオルガノイド研究にも利用することができ、ヒト臓器構造を考慮する。
Protocol
Representative Results
Discussion
CMSは、注入されたすべての細胞が無駄なくマイクロウェルに入り、従来のマイクロウェルベースの回転楕円体生成方法よりも効率的で経済的なシステムです。CMSシステムでは、チップ内のメディアを取り外すために設計された吸引穴を通して、メディアは12~24時間ごとに交換されます(図3A)。メディア吸引プロセスの間、メディアとマイクロウェルの壁との間の表面張力?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NRFの基礎科学研究プログラム(2016R1D1A1B0393934418)と生物医療技術開発プログラム(2018M3A9H1023141)によって支援され、韓国政府MSITが資金を提供しました。
Materials
| 3D printer | Cubicon | 3DP-210F | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) | ATCC | PCS-500-011 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Contained 1% of completed medium and buffer |
| CellTracker Green CMFDA | Thermo Fisher Scientific | C2925 | 10 mM |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 10 mM |
| Computer numerical control (CNC) rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| DC motor | Nurielectricity Inc. | MB-4385E | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | Contained 10% of completed medium |
| human lung fibroblasts (MRC-5) | ATCC | CCL-171 | |
| Inventor 2019 | Autodesk | 3D computer-aided design program | |
| Petri dish Φ 150 mm | JetBiofill | CAD010150 | Surface Treated |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 11/6/9003 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Polycarbonate (PC) | Acrylmall | AC15PC | 200 x 200 x 15 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Trypsin | Gibco | 12604021 |
Referencias
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Investigación sobre el cáncer. 41 (7), 2980-2984 (1981).
- Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).
- Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
- Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).
- Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).
- Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
- Park, Y. -. S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).
- Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).
- Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).
- Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9 (4), (2017).
- Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
- Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
