Plataforma Lab-on-a-CD para generar esferoides tridimensionales multicelulares

Summary

Presentamos un dispositivo microfluídico centrífugo motorizado que puede cultivar esferoides celulares. Usando este dispositivo, los esferoides de uno o varios tipos de células podrían ser fácilmente cocultivos bajo condiciones de alta gravedad.

Abstract

Un cultivo de células esferoides tridimensionales puede obtener resultados más útiles en experimentos celulares porque puede simular mejor los microambientes celulares del cuerpo vivo que el cultivo celular bidimensional. En este estudio, fabricamos una plataforma eléctrica de laboratorio en un CD (disco compacto), llamada sistema de cultivo de esferoides microfluídicos centrífugos (CMS), para crear esferoides celulares tridimensionales (3D) que implementan una alta fuerza centrífuga. Este dispositivo puede variar las velocidades de rotación para generar condiciones de gravedad de 1 x g a 521 x g. El sistema CMS tiene 6 cm de diámetro, tiene cien micropocillos de 400 m y se realiza mediante moldeo con polidimetilsiloxano en un molde de policarbonato prefabricado por una máquina de control numérico por ordenador. Una pared de barrera en la entrada del canal del sistema CMS utiliza fuerza centrífuga para esparcir las células uniformemente dentro del chip. Al final del canal, hay una región de diapositivas que permite que las celdas entren en los micropozos. Como demostración, los esferoides fueron generados por el monocultivo y la cocultura de células madre derivadas de adiposos humanos y fibroblastos pulmonares humanos en condiciones de alta gravedad utilizando el sistema. El sistema CMS utilizó un esquema de operación simple para producir esferoides de cocultura de varias estructuras de concéntrico, Janus y sándwich. El sistema CMS será útil en estudios de biología celular e ingeniería de tejidos que requieren esferoides y cultivo organoide de tipos de células simples o múltiples.

Introduction

Es más fácil simular microambientes biológicos in vivo con cultivo de células esferoides tridimensionales (3D) que con cultivo celular bidimensional (2D) (por ejemplo, cultivo celular de placa Petri convencional) para producir un cultivo experimental experimental más fisiológicamente realista resultados¹. Los métodos de formación de esferoides actualmente disponibles incluyen la técnica de gota colgante^2,la técnica de superposición de líquido sin carga^3,la técnica de carboximetilcelulosa^4,la técnica microfluídica basada en la fuerza magnética^5,y el uso de biorreactores⁶. Aunque cada método tiene sus propios beneficios, es necesaria una mejora adicional en la reproducibilidad, la productividad y la generación de esferoides de cocultura. Por ejemplo, mientras que la técnica microfluídica basada en la fuerza magnética⁵ es relativamente barata, los efectos de los campos magnéticos fuertes en las células vivas deben ser cuidadosamente considerados. Los beneficios del cultivo esferoide, particularmente en el estudio de la diferenciación y proliferación de células madre mesenquimales, se han divulgado en varios estudios^7,8,9.

El sistema microfluídico centrífugo, también conocido como laboratorio en un CD (disco compacto), es útil para controlar fácilmente el fluido en el interior y explotar la rotación del sustrato y, por lo tanto, se ha utilizado en aplicaciones biomédicas como los inmunoensayos^10, ensayos colorimétricos para la detección de marcadores bioquímicos¹¹, ensayos de amplificación de ácido nucleico (PCR), sistemas automatizados de análisis de sangre¹²y dispositivos microfluídicos centrífugos todo en uno¹³. La fuerza motriz que controla el fluido es la fuerza centrípeta creada por rotación. Además, múltiples funciones de mezcla, válvula y división de muestras se pueden hacer simplemente en esta única plataforma de CD. Sin embargo, en comparación con los métodos de análisis bioquímicos antes mencionados, ha habido menos ensayos aplicando plataformas de CD a las células de cultivo, especialmente los esferoides^14.

En este estudio, mostramos el rendimiento del sistema centrífugo de esferoides microfluídicos (CMS) por monocultivo o cocultivo de células madre derivadas de adiposos humanos (hASC) y fibroblastos pulmonares humanos (MRC-5). Este artículo describe en detalle la metodología de investigación de nuestro grupo¹⁵. Por lo tanto, la plataforma de laboratorio en un CD de cultivo de esferoide se puede reproducir fácilmente. Se presenta un sistema de generación CMS que comprende un chip de cultivo CMS, un soporte de chip, un motor de CC, un soporte de motor y una plataforma giratoria. El soporte del motor está impreso en 3D con acrilonitrilo butadieno estireno (ABS). El soporte de viruta y la plataforma giratoria son CNC (control numérico por ordenador) mecanizado con el PC (policarbonato). La velocidad de rotación del motor se controla de 200 a 4.500 rpm mediante la codificación de un algoritmo PID (proporcional-integral-derivado) basado en la modulación de ancho de pulso. Sus dimensiones son de 100 mm x 100 mm x 150 mm y pesa 860 g, por lo que es fácil de manejar. Usando el sistema CMS, los esferoides se pueden generar bajo diversas condiciones de gravedad de 1 x g a 521 x g,por lo que el estudio de la promoción de la diferenciación celular bajo alta gravedad se puede extender de las células 2D^16,17 a 3D Esferoide. La cocultura de varios tipos de células es también una tecnología clave para imitar eficazmente el entorno in vivo^18. El sistema CMS puede generar fácilmente esferoides de monocultivo, así como esferoides de cocultura de varios tipos de estructura (por ejemplo, concéntrico, janus y sándwich). El sistema CMS se puede utilizar no sólo en estudios simples de esferoides, sino también en estudios de organoides 3D, para considerar las estructuras de órganos humanos.

Protocol

1. Fabricación de chips de cultivo de esferoides (CMS) de base microfluídica centrífuga Haga moldes de PC para las capas superior e inferior de la viruta de cultivo CMS mediante mecanizado CNC. Las dimensiones detalladas del chip se indican en la Figura 1. Mezcle la base PDMS y el agente de curado PDMS con una proporción de 10:1 (p/p) durante 5 min y colóquelo en un desecador durante 1 h para eliminar las burbujas de aire. Después de verter la mezcla PDMS …

Representative Results

El chip de cultivo CMS de 6 cm de diámetro(Figura 2)se hizo con éxito siguiendo el protocolo anterior. En primer lugar, el chip se hizo por separado de una capa superior y una capa inferior y luego unido por unión por plasma. Los esferoides resultantes se pueden recoger fácilmente desplazándose el chip. El canal del chip de cultivo CMS comprende un puerto de entrada y regiones centrales, de diapositivas y de micropozos(Figura 3). Las soluciones celular, med…

Discussion

El CMS es un sistema cerrado en el que todas las células inyectadas entran en el micropozo sin residuos, haciéndolo más eficiente y económico que los métodos convencionales de generación de esferoides basados en micropozos. En el sistema CMS, el medio se reemplaza cada 12-24 h a través de un orificio de aspiración diseñado para quitar el medio en el chip(Figura 3A). Durante el proceso de succión de medios, apenas cualquier medio escapa del interior del micropozo debido a la tensió…

Materials

3D printer	Cubicon	3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC)	ATCC	PCS-500-011
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDA	Thermo Fisher Scientific	C2925	10 mM
CellTracker Red CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	10 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraver	Roland DGA	EGX-350
DC motor	Nurielectricity Inc.	MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)	ATCC	30-2200
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020	Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5)	ATCC	CCL-171
Inventor 2019	Autodesk		3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mm	JetBiofill	CAD010150	Surface Treated
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	11/6/9003	Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC)	Acrylmall	AC15PC	200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Trypsin	Gibco	12604021