פלטפורמת מעבדה-על-CD ליצירת רב-תאיים תלת מימדי
Summary
אנחנו מציגים מכשיר מיקרופלואידיסי צנטריפוגלי מנוע שיכול לטפח את התאים הניידים. באמצעות התקן זה, הספרואידים של סוגי תא יחיד או מרובים יכול להיות בקלות מתורבת בתנאי כבידה גבוהה.
Abstract
תרבות תא ספרואיד תלת מימדי יכולה להשיג תוצאות שימושיות יותר בניסויים בתאים, משום שהוא יכול לדמות טוב יותר מיקרוסביבות תאים של הגוף החי מאשר תרבות תא דו-ממדית. במחקר זה, אנו מפוברק מנוע חשמלי מונחה מעבדה-on-a-CD (קומפקט דיסק) פלטפורמה, המכונה מערכת מבוססי מיקרופלואידיג צנטריפוגלי (CMS) התרבות, כדי ליצור תלת מימדי (3D) מספרי טלפון של תאים המיישמים כוח צנטריפוגלי גבוה. התקן זה יכול לשנות את מהירויות הסיבוב כדי ליצור תנאי הכבידה מ 1 x g כדי 521 x g. מערכת CMS היא 6 ס מ קוטר, יש 500 יקרומטר המיקרוגל, והוא נעשה על ידי דפוס עם polydiמתיל siloxane בתבנית פוליקרבונט מראש על ידי מחשב בקרה מספרית. חומת מחסום בכניסה לערוץ של מערכת CMS משתמשת בכוח צנטריפוגלי כדי לפזר תאים באופן שווה בתוך השבב. בסוף הערוץ, יש אזור שקופית המאפשר לתאים להיכנס למיקרוגל. כהדגמה, נוצרו הספרואידים על ידי תרבות חד-תרבותית ומקודת של תאי גזע האדם הנגזר של אדיפוז והריאות האנושית בתנאי כבידה גבוהה באמצעות המערכת. מערכת ה-CMS השתמשה בתוכנית פעולה פשוטה כדי לייצר מספרי התרבות של מבנים שונים של קונצנטריים, יאנוס וכריכים. מערכת CMS יהיה שימושי בביולוגיה התא ולימודי הנדסת רקמות הדורשות spheroids ותרבות אורגאידית של סוגי תא יחיד או מרובים.
Introduction
קל יותר לדמות ביולוגי בvivo מיקרו-סביבות עם תלת מימדי (3D) תרבות תא ספרואיד מאשר עם 2-מימדי (2D) תרבות התא (g., המקובלת בצלחת פטרי התרבות תאים) כדי לייצר ניסוי מציאותי יותר מבחינה פיזיולוגית תוצאות1. שיטות היווצרות הספרואיד הזמינות כוללות את טכניקת השחרור התלויה2, טכניקת כיסוי נוזלי3, טכניקה תאית מגנטית4, טכניקת microfluidic מגנטי מבוסס כוח5, והשימוש ב שחקני המשך6. למרות שלכל שיטה יש יתרונות משלה, שיפור נוסף באופן הנקרא, פרודוקטיביות ויצירת הספרואידים מניבים הכרחי. לדוגמה, בעוד טכניקת microflu, מבוססי כוח מגנטית5 היא זולה יחסית, ההשפעות של שדות מגנטיים חזקים על תאי החיים חייבים להיחשב בזהירות. היתרונות של תרבות ספרואיד, במיוחד בחקר תא גזע mesenchymal והתפשטות, דווחו במספר מחקרים7,8,9.
מערכת מיקרופלואידיג צנטריפוגלי, הידוע גם בשם lab-על-a-CD (קומפקט דיסק), הוא שימושי עבור בקלות שליטה על הנוזל הפנימי וניצול הסיבוב של המצע, ובכך מנוצל יישומים ביו כגון חיסוני10, מטרי הצביעה בחני לזיהוי סמנים ביוכימיים11, הגברה חומצות גרעין (PCR) בחני, מערכות ניתוח דם אוטומטי12, ו-all-in-one צנטריפוגלי מיקרופלואידיc מכשירים13. הכוח המניע השולט בנוזל הוא כוח הצנטריות שנוצר בסיבוב. בנוסף, פונקציות מרובות של ערבוב, ולינג, פיצול לדוגמה ניתן לעשות פשוט בפלטפורמה זו תקליטור יחיד. עם זאת, בהשוואה לשיטות הניתוח הנ ל, היו פחות ניסיונות להחיל פלטפורמות תקליטור לתאי תרבות, במיוחד spheroids14.
במחקר זה, אנו מראים את הביצועים של מערכת ספרואיד מבוססי מיקרופלוטואידים (CMS) על ידי המערכת המבוססת על בסיס חד-תרבותי או התרבות של תאי הגזע האנושי הנגזר של אדיפוז (hASC) ופיברוהכדורים לריאות האדם (MRC-5). המאמר מתאר בפרוטרוט את מתודולוגיית המחקר של הקבוצה שלנו15. כך ניתן לשכפל בקלות את התרבות הספרואידית המעבדת על-גבי התקליטור. מערכת להפקת CMS הכוללת שבב תרבות CMS, מחזיק שבב, מנוע DC, הר מוטורי, ופלטפורמה מסתובבת, מוצג. הר המנוע הוא 3D מודפס עם יריעות אקריניטריל בוטטירן (ABS). מחזיק שבב ופלטפורמה מסתובבת הם CNC (שליטה מספרית המחשב) מחובר עם המחשב (פוליקרבונט). המהירות המסתובבת של המנוע נשלטת מ 200 כדי 4,500 סל ד על ידי קידוד (PID-אינטגרלי-נגזרים) אלגוריתם מבוסס על אפנון רוחב הדופק. הממדים שלה הם 100 mm x 100 mm x 150 mm וזה שוקל 860 g, מה שהופך אותו קל לטפל. באמצעות מערכת CMS, spheroids ניתן לייצר בתנאי כבידה שונים מ 1 x g כדי 521 x g, כך המחקר של בידול התא קידום תחת כבידה גבוהה ניתן להאריך מ 2d תאים16,17 כדי 3d ספרואיד. Coculture של סוגים שונים של תאים היא גם טכנולוגיה מרכזית לחיקוי יעיל של הסביבה vivo18. מערכת ה-CMS יכולה בקלות לייצר מונורואידים, כמו גם הספרואידים של מבנים מסוגים שונים (למשל, קונצנטריים, יאנוס וכריכים). מערכת CMS יכול להיות מנוצל לא רק במחקרים ספרואיד פשוט אלא גם במחקרים אורגאיד 3D, כדי לשקול מבנים איברים אנושיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
CMS הוא מערכת סגורה שבה כל התאים המוזרקים להיכנס למיקרוגל ללא בזבוז, מה שהופך אותו יעיל יותר וחסכוני יותר מאשר שיטות הדור המבוסס על מבוססי המיקרוגל. במערכת CMS, התקשורת מוחלפת מדי 12-24 שעות דרך חור יניקה שנועד להסיר את המדיה בשבב (איור 3A). במהלך השאיבה מדיה, בקושי כל אמצעי התקשור?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה היה נתמך על ידי התוכנית הבסיסית לחקר המדע (2016R1D1A03934418) ותוכנית ביו & טכנולוגיה רפואית (2018M3A9H1023141) של ה-NRF, וממומן על ידי הממשלה הקוריאנית, MSIT.
Materials
| 3D printer | Cubicon | 3DP-210F | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) | ATCC | PCS-500-011 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Contained 1% of completed medium and buffer |
| CellTracker Green CMFDA | Thermo Fisher Scientific | C2925 | 10 mM |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 10 mM |
| Computer numerical control (CNC) rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| DC motor | Nurielectricity Inc. | MB-4385E | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | Contained 10% of completed medium |
| human lung fibroblasts (MRC-5) | ATCC | CCL-171 | |
| Inventor 2019 | Autodesk | 3D computer-aided design program | |
| Petri dish Φ 150 mm | JetBiofill | CAD010150 | Surface Treated |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 11/6/9003 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Polycarbonate (PC) | Acrylmall | AC15PC | 200 x 200 x 15 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Trypsin | Gibco | 12604021 |
Referencias
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Investigación sobre el cáncer. 41 (7), 2980-2984 (1981).
- Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).
- Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
- Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).
- Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).
- Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
- Park, Y. -. S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).
- Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).
- Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).
- Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9 (4), (2017).
- Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
- Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
