Платформа Lab-on-a-CD для генерации многоклеточных трехмерных сфероидов
Summary
Мы представляем моторное центробежное микрофлюидное устройство, которое может культивировать клеточные сфероиды. С помощью этого устройства, сфероиды одного или нескольких типов клеток могут быть легко сконкультурированы в условиях высокой гравитации.
Abstract
Трехмерная культура сфероидных клеток может получить более полезные результаты в клеточных экспериментах, поскольку она может лучше имитировать клеточную микросреду живого тела, чем двухмерную клеточную культуру. В этом исследовании мы изготовили электромоторную платформу Lab-on-a-CD (compact disc), называемую центробежной микрофлюидной системой культуры сфероидов (CMS), чтобы создать трехмерные (3D) клеточные сфероиды, реализующие высокую центробежную силу. Это устройство может варьировать скорость вращения для создания условий гравитации от 1 х г до 521 х г. Система CMS имеет 6 см в диаметре, имеет сто 400 мкм микроуэллов, и производится путем литья с полидиметилсилоксаном в поликарбонатной плесени, сделанной компьютерным аппаратом управления числом. Барьерная стена на входе канала системы CMS использует центробежную силу для равномерного равномерного распределения клеток внутри чипа. В конце канала есть область слайда, которая позволяет клеткам входить в микроколодцы. В качестве демонстрации, сфероиды были созданы монокультуры и кокультуры человеческих жиров полученных стволовых клеток и легких фибробластов человека в условиях высокой гравитации с помощью системы. Система CMS использовала простую схему работы для производства сфероидов кокультуры различных структур концентрических, Янус, и сэндвич. Система CMS будет полезна в клеточной биологии и исследованиях тканей, которые требуют сфероидов и органоидной культуры одного или нескольких типов клеток.
Introduction
Легче моделировать биологические микросреды in vivo с трехмерной (3D) культурой сфероидных клеток, чем с двухмерной (2D) клеточной культурой (например, обычной культурой клеток петри) для получения более физиологически реалистичного экспериментального результаты1. В настоящее время доступны методы формирования сфероидов включают висячие капли техники2, жидкая накладка техника3, carboxymethyl целлюлозы техники4, магнитной силы на основе микрофлюидной техники5, и использование биореакторы6. Хотя каждый метод имеет свои преимущества, необходимо дальнейшее улучшение воспроизводимости, производительности и генерации сфероидов кокультуры. Например, в то время как микрофлюидная техника5 на основе магнитной силы является относительно недорогой, влияние сильных магнитных полей на живые клетки необходимо тщательно рассмотреть. Преимущества сфероидной культуры, особенно в изучении мезенхимальной дифференциации стволовых клеток и распространения, были зарегистрированы в нескольких исследованиях7,8,9.
Центробежная микрофлюидная система, также известная как lab-on-a-CD (компактный диск), полезна для легкого контроля жидкости внутри и использования вращения субстрата и, таким образом, была использована в биомедицинских приложениях, таких как иммуноанализы 10, колорометрические анализы для обнаружения биохимических маркеров11,усиление нуклеиновой кислоты (ПЦР), автоматизированные системы анализа крови12и все-в-одном центробежные микрофлюидные устройства13. Движущей силой, контролирующей жидкость, является центростремительная сила, создаваемый вращением. Кроме того, несколько функций смешивания, вальвинга и разделения образцов можно сделать просто в этой единственной платформе компакт-диска. Однако, по сравнению с вышеупомянутыми методами биохимического анализа, было меньше испытаний, применяющих CD-платформы к культурным клеткам, особенно сфероидам14.
В этом исследовании мы показываем производительность центробежной микрофлюидной сфероидной системы (CMS) путем монокультуры или кокультуры стволовых клеток человека, полученных из жиров (hASC) и фибробластов легких человека (MRC-5). В этой статье подробно описывается методология исследования нашей группы15. Таким образом, платформа сфероидной культуры-на-CD может быть легко воспроизведена. Представлена система генерации CMS, включающая чип культуры CMS, держатель чипа, двигатель постоянного тока, моторную установку и вращающуюся платформу. Моторная крепление напечатано 3D с акрилонитрилом бутадиена стирола (ABS). Держатель чипа и вращающаяся платформа cNC (компьютерный цифровой контроль) отражаются с ПК (поликарбонат). Скорость вращения двигателя контролируется от 200 до 4500 об/мин путем кодирования PID (пропорционально-интегрально-производной) алгоритма на основе импульсно-ширинной модуляции. Его габариты 100 мм х 100 мм х 150 мм и вес 860 г, что делает его легким в обращении. Используя систему CMS, сфероиды могут быть созданы в различных условиях гравитации от 1 х г до 521 х г,поэтому изучение содействия дифференциации клеток в условиях высокой гравитации может быть продлено с 2D-клеток16,17 до 3D Сфероида. Кокультура различных типов клеток также является ключевой технологией для эффективного имитирования среды in vivo18. Система CMS может легко генерировать монокультурные сфероиды, а также сфероиды кокультуры различных типов структур (например, концентрические, янус ы, и сэндвич). Система CMS может быть использована не только в простых сфероидных исследованиях, но и в 3D органоидных исследованиях, для рассмотрения структур органов человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
CMS является закрытой системой, в которой все инъекционные клетки попадают в микроскважину без отходов, что делает его более эффективным и экономичным, чем обычные методы генерации сфероидов на основе микроскважин. В системе CMS, средства массовой информации заменяется каждые 12-24 ч через …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Программой фундаментальных научных исследований (2016R1D1A1B03934418) и Программой развития био- и медицинских технологий (2018M3A9H1023141) NRF и финансируется корейским правительством, MSIT.
Materials
| 3D printer | Cubicon | 3DP-210F | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) | ATCC | PCS-500-011 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Contained 1% of completed medium and buffer |
| CellTracker Green CMFDA | Thermo Fisher Scientific | C2925 | 10 mM |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 10 mM |
| Computer numerical control (CNC) rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| DC motor | Nurielectricity Inc. | MB-4385E | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | Contained 10% of completed medium |
| human lung fibroblasts (MRC-5) | ATCC | CCL-171 | |
| Inventor 2019 | Autodesk | 3D computer-aided design program | |
| Petri dish Φ 150 mm | JetBiofill | CAD010150 | Surface Treated |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 11/6/9003 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Polycarbonate (PC) | Acrylmall | AC15PC | 200 x 200 x 15 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Trypsin | Gibco | 12604021 |
Referencias
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Investigación sobre el cáncer. 41 (7), 2980-2984 (1981).
- Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).
- Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
- Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).
- Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).
- Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
- Park, Y. -. S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).
- Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).
- Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).
- Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9 (4), (2017).
- Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
- Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
