使用无细胞细菌提取物、脂质体和乳液转移制备蛋白质生成合成细胞

Summary

该协议描述了用于自下而上制备RNA和产生合成细胞的蛋白质的方法、材料、设备和步骤。合成细胞的内水腔含有S30细菌裂解，封装在脂质双层层（即稳定脂质体）内，使用油水乳液转移方法。

Abstract

合成细胞构造的自下而上装配方法是隔离和研究细胞模拟环境中细胞过程的有效工具。此外，无细胞表达系统的发展已经证明了以受控方式重组蛋白质生产、转录和翻译过程（DNA+RNA+蛋白质）的能力，利用合成生物学。在这里，我们描述了一种制备无细胞表达系统的协议，包括生产一种有效的细菌水合物，并将这种水泡封装在富含胆固醇的脂质型巨型单层囊泡（GUVs）（即稳定脂质体）内，以形成合成细胞。该协议描述了合成细胞成分的准备方法，包括活性细菌裂解物的产生，然后根据油水乳液转移方法对合成细胞进行详细的逐步制备。这些有助于以简单和负担得起的方式生产数百万个合成细胞，具有用于生产不同类型的蛋白质的高多功能性。所得合成细胞可用于研究分离环境中的蛋白质/RNA的产生和活性，在定向进化中，以及作为在体内按需生产治疗蛋白的受控药物输送平台。

Introduction

合成细胞是类似细胞的人造粒子，模仿活细胞的一个或多个功能，如分裂、形成膜相互作用和根据遗传代码^{11、2、32,3}合成蛋白质的能力。包含无细胞蛋白合成（CFPS）系统的合成细胞具有很高的模块化，因为它们能够在DNA模板发生改变后产生各种蛋白质和RNA序列。CFPS系统以细胞裂解、纯化成分或合成成分为基础，提供一种有吸引力的替代蛋白，包括蛋白质合成所需的所有转录和翻译机制，如核糖体、RNA聚合酶、氨基酸和能量源（例如，三磷甘油酸盐和三磷酸腺）4、5、6、7、8、9。^4,5,6,7,8,9将CFPS系统封装在脂质囊泡内，无需依赖活细胞¹⁰即可简单高效地生产蛋白质。此外，该平台允许合成可能在自然细胞内降解的肽，产生对活细胞有毒的蛋白质，以及用非天然氨基酸^11，12,12修饰蛋白质。合成细胞已被作为研究目的的模型，研究从进化角度^1，13,13实现细胞寿命所需的最小细胞成分。合成细胞也被用来建立和实施遗传回路，并作为定向进化的模型^{14，15，16。15,1614}其他研究的重点是合成细胞模仿自然细胞生物活动的能力，旨在取代受损的自然细胞，如糖尿病患者的β细胞^。此外，这些CFPS封装合成细胞产生各种治疗性蛋白质的能力说明了其潜力，被纳入临床使用^18。

在这里，我们描述了一个自下而上的实验室规模协议（图1），用于生产基于CFPS系统封装在脂质囊泡中的RNA和产生蛋白质的合成细胞。这表明，合成细胞平台作为新型药物输送系统，用于在体内生产治疗性蛋白质药物^的可能性。以前的研究已经研究了CFPS反应和细胞水合制剂过程^{44，8，208,20}的优化。此外，还应用了几种细胞大小的脂质体制备技术，如微流体和聚合物基液滴稳定方法^{21、22、23，,22,}在脂质体脂质组成^{24、25、2625,26}中也有所不同²⁴。²³在所介绍的协议中，合成细胞采用水浸液转移法产生，封装过程在低温（<4°C）5、10、24、27、28^{5,10,24,27,28}下进行。这些温和的条件被发现有利于保持分子机械的生物功能完整性，即核糖体和蛋白质27，29，30。^27,29,30颗粒的脂质组成由胆固醇和1-棕榈-2-奥莱基-sn-糖-3-磷脂素（POPC）组成。第一种存在于所有哺乳动物细胞膜中，对膜的稳定性、刚度和渗透性降低至关重要，后者模仿哺乳动物磷脂成分^{11、13。11,}细胞转录和转化分子机械从BL21（DE3）大肠杆菌（大肠杆菌）菌株中提取，该菌株由pAR1219质粒过度表达T7RNA聚合酶转化，以增加CFPS效力和蛋白质合成。该系统已用于产生诊断和治疗蛋白，³¹体外和体内¹⁹的分子量高达66^kDa。以下协议为合成细胞系统的生产提供了一种简单而有效的方法，可以解决与自然界中蛋白质合成相关的广泛基本问题，也可用于药物输送应用。

Protocol

注：图1中介绍了完整的合成细胞生产协议的图示。根据用户的需求，协议的蛋白质表达（第3.2节）和合成细胞形成（第4节）部分也可以独立进行（进行一些调整）。 1. 制备S30-T7莱沙 条纹板大肠杆菌BL21（DE3）细菌转化与T7RNA聚合酶表达pAR1219质粒在LB-agar板补充50微克/mL安培霉素，以获得单菌落。 准备启动溶液：将单个菌体接种成5 mL…

Representative Results

我们提出了一种合成细胞制备协议，通过封装基于BL21大肠杆菌体内脂质囊泡的S30-T7 CFPS系统。图 2中介绍了准备过程的原理图描述，其中包括每个阶段的图像。合成细胞制备过程的成功取决于每个阶段的适当性能，并受不同参数的影响。应调整协议以适应特定蛋白质的产生。 在CFPS散量反应和合成细胞中，将表达模型蛋白超级文件夹绿色荧光蛋白?…

Discussion

该协议引入了一种简单且经济的方法，用于生产大量产生蛋白质的合成细胞。活性细胞的产生取决于谨慎和准确地执行协议，并侧重于几个关键步骤。在该方法的精致部分，在细胞水致之前达到适当的细菌密度，在细菌水致酶中达到足够数量的蛋白质至关重要。其次，在4°C下进行流化过程，用液氮快速冷冻液化酶，以保持蛋白质活性。此外，在该协议中，我们使用大肠杆菌BL21（DE3）细胞?…

Materials

A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)
E.coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	E.coli BL21 (DE3).
pAR1219	Sigma	T2076	TargeTron vector for transformation.
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin	Sigma	A9518	Stored at -20 °C.
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
15 g/L Agar agar purified	Merck	1.01614.5007
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
12 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).
24 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
4% (v/v) Glycerol anhydrous	Bio-Lab	7120501
2.32 g/L K2HPO4	Spectrum chemical	P1383
12.54 g/L KH2PO4	Spectrum chemical	P1380
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)	TCI	D1071	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4	Sigma	T1503	S30 lysate buffer (1.5 L)
14 mM magnesium acetate	Merck	1.05819.0250
60 mM potassium acetate	Carlo Erba	470147
1 mM DTT	TCI	D1071
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Equipment required for step 1
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks	Thermo Scientific	50-154-2846	2 flasks
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles	KIMAX-KIMBLE	25630	2 flasks
Floor incubator shaker	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g.     * Pre-cooled to 4 °C.
High pressure homogenizer	AVESTIN	EmulsiFlex-C3	Pre-cooled to 4 °C.
-80oC freezer	SO-LOW	U85-18
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Spectrophotometer	TECAN	IN-MNANO	Infinite M200 pro
96-well transparent plate	Thermo Scientific	167008
Sterilized graduated cylinder	Corning
Sterilized centrifuge tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Sterilized pipette tips	Corning		Preferably pre-cooled to -20 °C.
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
Small liquid nitrogen tank	NALGENE	4150-4000
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Lipoid	556400	Powder
Cholesterol	Sigma	C8667	Powder
Chloroform	Bio-Lab	3082301
Mineral oil	Sigma	M5904	Light oil
Equipment required for step 2
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Heating block	TECHNE	FDB03AD	Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature.
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232	For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.
9mm Screw Cap	CSI Analytical Innovations	C395R-09LC
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):
HEPES	Spectrum	H1089	1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer
Potassium hydroxide (KOH)	Frutarom	55290
1 M Magnesium acetate	Merck	1.05819.0250	Co-factor and negative charge stabilizor.
1 M Potassium acetate	Carlo Erba	470147	Negative charge stabilizor.
5.2 M Ammonium acetate	Merck	1.01116.1000	Stabilizes negative charge.
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)	Merck	8.07491.1000	Increases the concentration of the macromolecules.
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)	Sigma	P8877	Secondary energy source.
50 mM Amino acids mixture I	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17  natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.
50 mM Amino acids mixture II	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.
100 mM Adenine triphosphate (ATP)	Sigma	A3377	Nucleotides & energy source.
50 mM Guanidine triphosphate (GTP)	Sigma	G8877	Nucleotides & energy source.
100 mM Uridine triphosphate (UTP)	ACROS ORGANICS	226310010	Nucleotides additive.
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Genes expression induction.
2 M Sucrose	J.T. Baker	1933078	Generating a density gradient.
2 M Glucose	Sigma	16301	Generating a density gradient.
H2O UltraPure Water (UPW)	Bio-Lab	2321777500	DNase & RNase free
S30-T7 lysate	_	_	Prepared at step 1.                                                                        Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage.
Stock of DNA plasmid of choice	_	_	Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)
Floor incubator shaker or Thermomixer	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
	PHMT Grant Bio	PSC18	Thermomixer
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C.
Table centrifuge	Thermo Scientific	75002420	(75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C.
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232
Sterile 15 mL plastic tubes	Thermo Scientific	339651
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086
Sterilized pipette tips	Corning		Sterilized by autoclave.