Preparando proteínas que produzem células sintéticas usando extratos bacterianos livres de células, liposomos e transferência de emulsão

Summary

Este protocolo descreve o método, materiais, equipamentos e etapas para a preparação de baixo para cima de RNA e proteína susceptíveis de produzir células sintéticas. O compartimento aquoso interno das células sintéticas continha o lisato bacteriano S30 encapsulado dentro de uma bicamada lipídica (ou seja, lipossomos estáveis), utilizando um método de transferência de emulsão de água no óleo.

Abstract

A abordagem de montagem de baixo para cima para a construção de células sintéticas é uma ferramenta eficaz para isolar e investigar processos celulares em um ambiente de imitação celular. Além disso, o desenvolvimento de sistemas de expressão livre de células demonstrou a capacidade de reconstituir os processos de produção, transcrição e tradução de proteínas (DNA→RNA→protein) de forma controlada, aproveitando a biologia sintética. Aqui descrevemos um protocolo para preparar um sistema de expressão livre de células, incluindo a produção de um potente lisato bacteriano e encapsulamento deste lisato dentro de vesículas unilamelares gigantes (GUVs) ricas em colesterol( ou seja, lipossomos estáveis), para formar células sintéticas. O protocolo descreve os métodos para a preparação dos componentes das células sintéticas, incluindo a produção de lisatos bacterianos ativos, seguido de uma preparação detalhada passo a passo das células sintéticas com base em um método de transferência de emulsão de água em óleo. Estes facilitam a produção de milhões de células sintéticas de forma simples e acessível, com alta versatilidade para a produção de diferentes tipos de proteínas. As células sintéticas obtidas podem ser utilizadas para investigar a produção e a atividade de proteína/RNA em um ambiente isolado, em evolução direcionada, e também como uma plataforma controlada de entrega de medicamentos para produção sob demanda de proteínas terapêuticas dentro do corpo.

Introduction

As células sintéticas são partículas artificiais semelhantes a células, imitando uma ou múltiplas funções de uma célula viva, como a capacidade de se dividir, formar interações de membrana e sintetizar proteínas com base em um código genético^1,2,3. Células sintéticas que encerram sistemas de síntese proteica livre de células (CFPS) possuem alta modularidade devido à sua capacidade de produzir várias proteínas e seqüências de RNA após alterações no modelo de DNA. Apresentando uma alternativa atraente às abordagens atuais da produção de proteínas, os sistemas CFPS baseiam-se em lisato celular, componentes purificados ou componentes sintéticos e incluem todas as máquinas de transcrição e tradução necessárias para a síntese de proteínas como ribossomos, Polimerase de RNA, aminoácidos e fontes de energia (por exemplo, 3-fosfoliglicerato e adenina^,tripofatos)^4,5,6,7, 8^,8.⁹ O encapsulamento de um sistema CFPS dentro de vesículas lipídicas permite a produção simples e eficiente de proteínas sem depender de uma célula viva¹⁰. Além disso, esta plataforma permite a síntese de peptídeos que podem se degradar dentro das células naturais, a produção de proteínas tóxicas para as células vivas e a modificação de proteínas com aminoácidos não naturais^11,12. As células sintéticas têm sido utilizadas como modelo para fins de pesquisa investigando os componentes celulares mínimos necessários para permitir a vida celular a partir de uma perspectiva evolutiva^1,13. As células sintéticas também têm sido utilizadas para construir e implementar circuitogenético e como modelos para evolução dirigida^14,,15,,16. Outros estudos têm focado na capacidade das células sintéticas de imitar a atividade biológica das células naturais, visando substituir células naturais danificadas, como células beta em pacientes com diabetes¹⁷. Além disso, a capacidade dessas células sintéticas encapsuladas cfps de produzir uma variedade de proteínas terapêuticas ilustra seu potencial para serem incorporadas ao uso clínico¹⁸.

Aqui descrevemos um protocolo de escala de laboratório de baixo para cima (Figura 1) para a produção de RNA e células sintéticas produtoras de proteínas com base em um sistema CFPS encapsulado em uma vesícula lipídica. Isso mostra o potencial uso de plataformas de células sintéticas como novos sistemas de entrega de medicamentos para a produção in loco de uma droga de proteína terapêutica in vivo¹⁹. Estudos anteriores têm investigado a otimização da reação cfps e os processos de preparação de lésa celular^4,8,20. Além disso, várias técnicas têm sido aplicadas para a preparação do liposome do tamanho celular, tais como os métodos de estabilização de gotículas microfluidas e baseadas em polímeros^21,,22,23, que também diferem na composição lipídica dos liposóis^24,,25,26. No protocolo apresentado, as células sintéticas são produzidas utilizando-se um método de transferência de emulsão de água-no-óleo e o processo de encapsulamento é realizado a baixas temperaturas (<4 °C)^{5,10,24,27,28}. Estas condições leves têm sido favoráveis para a manutenção da integridade biofuncional das máquinas moleculares, ou seja, ribossomos e proteínas^27,29,30. A composição lipídica das partículas consiste tanto no colesterol quanto no 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glicero-3-fosfocholine (POPC). A primeira é encontrada em todas as membranas celulares dos mamíferos e é essencial para a estabilidade, rigidez e redução da permeabilidade da membrana, e esta última imita a composição fosfolipídea dos mamíferos^11,13. A transcrição celular e a maquinaria molecular de tradução são extraídas da cepa BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), que é transformada com pAR1219 plasmídeo superexpressor t7 rna polimerase para aumentar a potência cfps e a síntese de proteínas. Este sistema tem sido utilizado para produzir proteínas diagnósticas e terapêuticas, com pesos moleculares de até 66 kDa in vitro e in vivo^19,31. O protocolo a seguir fornece um método simples e eficaz para a produção do sistema celular sintético, que pode abordar uma ampla gama de questões fundamentais associadas à síntese proteica na natureza e também pode ser utilizado para aplicações de entrega de medicamentos.

Protocol

NOTA: A ilustração do protocolo completo de produção das células sintéticas é apresentada na Figura 1. De acordo com as necessidades do usuário, a expressão proteica (seção 3.2) e a formação de células sintéticas (seção 4) do protocolo também podem ser realizadas independentemente (com algumas adaptações). 1. Preparação do lysate S30-T7 Placa de raia a bactéria E. coli BL21(DE3) transformada com a polimerase T7 RNA express…

Representative Results

Apresentamos um protocolo para a preparação de células sintéticas encapsulando um sistema CFPS S30-T7 baseado em BL21 E. coli dentro de vesículas lipídicas. Uma descrição esquemmática do processo de preparação que inclui uma imagem de cada etapa é apresentada na Figura 2. O sucesso do processo de preparação de células sintéticas depende do desempenho adequado de cada etapa e efetuado por diferentes parâmetros. O protocolo deve ser ajustado para acomodar a produção…

Discussion

Este protocolo introduz um método simples e acessível para a produção de grandes quantidades de células sintéticas produtoras de proteínas. O rendimento das células ativas depende da execução cuidadosa e precisa do protocolo com ênfase em várias etapas críticas. Na seção de preparação de lisato deste método, é essencial alcançar a densidade de bactérias apropriada antes da lse celular para alcançar uma quantidade suficiente de proteínas no lisato bacteriano. Em segundo lugar, o processo de lyse dev…

Materials

A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)
E.coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	E.coli BL21 (DE3).
pAR1219	Sigma	T2076	TargeTron vector for transformation.
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin	Sigma	A9518	Stored at -20 °C.
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
15 g/L Agar agar purified	Merck	1.01614.5007
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
12 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).
24 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
4% (v/v) Glycerol anhydrous	Bio-Lab	7120501
2.32 g/L K2HPO4	Spectrum chemical	P1383
12.54 g/L KH2PO4	Spectrum chemical	P1380
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)	TCI	D1071	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4	Sigma	T1503	S30 lysate buffer (1.5 L)
14 mM magnesium acetate	Merck	1.05819.0250
60 mM potassium acetate	Carlo Erba	470147
1 mM DTT	TCI	D1071
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Equipment required for step 1
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks	Thermo Scientific	50-154-2846	2 flasks
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles	KIMAX-KIMBLE	25630	2 flasks
Floor incubator shaker	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g.     * Pre-cooled to 4 °C.
High pressure homogenizer	AVESTIN	EmulsiFlex-C3	Pre-cooled to 4 °C.
-80oC freezer	SO-LOW	U85-18
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Spectrophotometer	TECAN	IN-MNANO	Infinite M200 pro
96-well transparent plate	Thermo Scientific	167008
Sterilized graduated cylinder	Corning
Sterilized centrifuge tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Sterilized pipette tips	Corning		Preferably pre-cooled to -20 °C.
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
Small liquid nitrogen tank	NALGENE	4150-4000
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Lipoid	556400	Powder
Cholesterol	Sigma	C8667	Powder
Chloroform	Bio-Lab	3082301
Mineral oil	Sigma	M5904	Light oil
Equipment required for step 2
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Heating block	TECHNE	FDB03AD	Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature.
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232	For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.
9mm Screw Cap	CSI Analytical Innovations	C395R-09LC
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):
HEPES	Spectrum	H1089	1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer
Potassium hydroxide (KOH)	Frutarom	55290
1 M Magnesium acetate	Merck	1.05819.0250	Co-factor and negative charge stabilizor.
1 M Potassium acetate	Carlo Erba	470147	Negative charge stabilizor.
5.2 M Ammonium acetate	Merck	1.01116.1000	Stabilizes negative charge.
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)	Merck	8.07491.1000	Increases the concentration of the macromolecules.
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)	Sigma	P8877	Secondary energy source.
50 mM Amino acids mixture I	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17  natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.
50 mM Amino acids mixture II	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.
100 mM Adenine triphosphate (ATP)	Sigma	A3377	Nucleotides & energy source.
50 mM Guanidine triphosphate (GTP)	Sigma	G8877	Nucleotides & energy source.
100 mM Uridine triphosphate (UTP)	ACROS ORGANICS	226310010	Nucleotides additive.
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Genes expression induction.
2 M Sucrose	J.T. Baker	1933078	Generating a density gradient.
2 M Glucose	Sigma	16301	Generating a density gradient.
H2O UltraPure Water (UPW)	Bio-Lab	2321777500	DNase & RNase free
S30-T7 lysate	_	_	Prepared at step 1.                                                                        Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage.
Stock of DNA plasmid of choice	_	_	Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)
Floor incubator shaker or Thermomixer	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
	PHMT Grant Bio	PSC18	Thermomixer
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C.
Table centrifuge	Thermo Scientific	75002420	(75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C.
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232
Sterile 15 mL plastic tubes	Thermo Scientific	339651
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086
Sterilized pipette tips	Corning		Sterilized by autoclave.