Dit protocol beschrijft de methode, materialen, apparatuur en stappen voor bottom-up voorbereiding van RNA en eiwit produceren synthetische cellen. Het binnenste waterige compartiment van de synthetische cellen bevatte de S30 bacteriële lysaat ingekapseld in een lipide tweelaag (dat wil zeggen, stabiele liposomen), met behulp van een water-in-olie emulsie overdracht methode.
De bottom-up assemblage benadering voor de bouw van synthetische cellen is een effectief instrument voor het isoleren en onderzoeken van cellulaire processen in een cel nabootsen omgeving. Bovendien heeft de ontwikkeling van celvrije expressiesystemen aangetoond dat het vermogen is om de eiwitproductie-, transcriptie- en vertaalprocessen (DNA→RNA→eiwit) op een gecontroleerde manier te reconstrueren, waarbij synthetische biologie wordt gebruikt. Hier beschrijven we een protocol voor de voorbereiding van een cel-vrije expressie systeem, met inbegrip van de productie van een krachtige bacteriële lysaat en inkapselen dit lysaat binnen cholesterol-rijke lipide-gebaseerde gigantische unilamellar vesicles (GUVs) (dat wil zeggen, stabiele liposomen), om synthetische cellen te vormen. Het protocol beschrijft de methoden voor de voorbereiding van de componenten van de synthetische cellen, met inbegrip van de productie van actieve bacteriële lysaten, gevolgd door een gedetailleerde stapsgewijze voorbereiding van de synthetische cellen op basis van een water-in-olie emulsie overdracht methode. Deze vergemakkelijken de productie van miljoenen synthetische cellen op een eenvoudige en betaalbare manier met een hoge veelzijdigheid voor het produceren van verschillende soorten eiwitten. De verkregen synthetische cellen kunnen worden gebruikt om de productie en activiteit van eiwitten/RNA te onderzoeken in een geïsoleerde omgeving, in gerichte evolutie, en ook als een gecontroleerd geneesmiddelenleveringsplatform voor on-demand productie van therapeutische eiwitten in het lichaam.
Synthetische cellen zijn kunstmatige celachtige deeltjes, die een of meerdere functies van een levende cel nabootsen, zoals het vermogen om te verdelen, membraaninteracties te vormen en eiwitten te synthetiseren op basis van een genetische code1,2,3. Synthetische cellen die celvrije eiwitsynthese (CFPS) systemen omsluiten bezitten een hoge modulariteit vanwege hun vermogen om verschillende eiwitten en RNA sequenties te produceren na veranderingen in de DNA-sjabloon. CFPS-systemen zijn gebaseerd op cellysaat, gezuiverde componenten of synthetische componenten en bieden een aantrekkelijk alternatief voor de huidige benaderingen van eiwitproductie en omvatten alle transcriptie- en vertaalmechanismen die nodig zijn voor eiwitsynthese, zoals ribosomen, RNA-polymerase, aminozuren en energiebronnen (bijvoorbeeld 3-fosfhoglyceren en adenine trifosfaat)4,5,6,7,8,9. De inkapseling van een CFPS-systeem in lipideblaasjes maakt de eenvoudige en efficiënte productie van eiwitten mogelijk zonder afhankelijk te zijn van een levende cel10. Bovendien, dit platform maakt synthese van peptiden die kunnen degraderen in natuurlijke cellen, de productie van eiwitten die giftig zijn voor levende cellen, en eiwitten te wijzigen met niet-natuurlijke aminozuren11,12. Synthetische cellen zijn gebruikt als een model voor onderzoeksdoeleinden het onderzoeken van de minimale celcomponenten die nodig zijn om cellulair leven mogelijk te maken vanuit een evolutionair perspectief1,13. Synthetische cellen zijn ook gebruikt voor het bouwen en implementeren van genetische circuits en als modellen voor gerichte evolutie14,15,16. Andere studies hebben zich gericht op het vermogen van synthetische cellen om de biologische activiteit van natuurlijke cellen na te bootsen, gericht op het vervangen van beschadigde natuurlijke cellen, zoals bètacellen bij patiënten met diabetes17. Bovendien illustreert het vermogen van deze CFPS om synthetische cellen in te kapselen om een verscheidenheid aan therapeutische eiwitten te produceren, het potentieel ervan om in klinisch gebruik te worden opgenomen18.
Hier beschrijven we een bottom-up lab-schaal protocol (Figuur 1) voor de productie van RNA en eiwitproducerende synthetische cellen op basis van een CFPS-systeem ingekapseld in een lipide blaasje. Dit toont het mogelijke gebruik van synthetische celplatforms als nieuwe systemen voor de levering van geneesmiddelen voor de on-site productie van een therapeutisch eiwitmedicijn in vivo19. Eerdere studies hebben de optimalisatie van de CFPS-reactie en de cellysaatvoorbereidingsprocessen4,8,20onderzocht. Bovendien zijn verschillende technieken toegepast voor liposoompreparaat ter grootte van celformaat, zoals microfluïdische en polymeergebaseerde druppelstabilisatiemethoden21,22,23, die ook verschillen in de lipidesamenstelling van liposomen24,25,26. In het gepresenteerde protocol worden synthetische cellen geproduceerd met behulp van een water-in-olie emulsieoverdrachtsmethode en wordt het inkapselingsproces uitgevoerd bij lage temperaturen (<4 °C)5,10,24,27,28. Deze milde omstandigheden bleken gunstig te zijn voor het behoud van de bio-functionele integriteit van de moleculaire machines, namelijk ribosomen en eiwitten27,29,30. De lipidesamenstelling van de deeltjes bestaat uit zowel cholesterol als 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC). De eerste is te vinden in alle zoogdiercelmembranen en is essentieel voor de stabiliteit, stijfheid en doorlaatbaarheid vermindering van het membraan, en de laatste bootst zoogdier fosfolipide samenstelling11,13. De cellulaire transcriptie en vertaling moleculaire machines worden gewonnen uit de BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) stam, die wordt getransformeerd met pAR1219 plasmid overexpressing T7 RNA polymerase om CFPS potentie en eiwitsynthese te verhogen. Dit systeem is gebruikt voor de productie van diagnostische en therapeutische eiwitten, met moleculaire gewichten tot 66 kDa in vitro es in vivo19,31. Het volgende protocol biedt een eenvoudige en effectieve methode voor de productie van het synthetische celsysteem, dat een breed scala aan fundamentele vragen in verband met eiwitsynthese in de natuur kan aanpakken en ook kan worden gebruikt voor toepassingen voor de levering van geneesmiddelen.
Dit protocol introduceert een eenvoudige en betaalbare methode voor de productie van grote hoeveelheden eiwitproducerende synthetische cellen. De opbrengst van actieve cellen is afhankelijk van een zorgvuldige en nauwkeurige uitvoering van het protocol met de nadruk op verschillende kritische stappen. In het lysaatpreparaat gedeelte van deze methode, is het essentieel om de juiste bacteriëndichtheid vóór cellyse te bereiken om een voldoende hoeveelheid proteïnen in het bacteriële lysaat te bereiken. Ten tweede moet …
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door ERC-STG-2015-680242.
De auteurs erkennen ook de steun van het Technion Integrated Cancer Center (TICC); het Russell Berrie Nanotechnology Institute; het Lorry I. Lokey Interdisciplinary Center for Life Sciences & Engineering; het Israëlische ministerie van Economie voor een Kamin-subsidie (52752); het Ministerie van Israël van De Technologie en de Ruimte van de wetenschap van Israël – Bureau van de Belangrijkste Wetenschapper (3-11878); de Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); de Israel Cancer Association (2015-0116); de Duits-Israëlische Stichting voor Wetenschappelijk Onderzoek en Ontwikkeling voor een GIF Young-subsidie (I-2328-1139.10/2012); het FP-7 IRG-programma van de Europese Unie voor een loopbaanintegratiebeurs (908049); het Phosfolipide Research Center Grant; een Rosenblatt Foundation for cancer research, een Mallat Family Foundation Grant; en de Unger Family Foundation. A. Schröder erkent Alon en Taub Fellowships. O. Adir erkent de Sherman en Gutwirth beurzen. G. Chen erkent de Sherman Fellowship. N. Krinsky erkent de barones Ariane de Rothschild Women Doctoral Program van de Rothschild Caesarea Foundation.
A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
1 mM DTT | TCI | D1071 | |
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
Equipment required for step 1 | |||
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
-80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
Equipment required for step 2 | |||
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer |
Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |