Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Methode, Materialien, Ausrüstung und Schritte zur Bottom-up-Vorbereitung von RNA und Protein produzierenden synthetischen Zellen. Das innere wässrige Fach der synthetischen Zellen enthielt das in einer Lipid-Bilayer (d. h. stabile Liposomen) eingekapselte S30-Bakterienlysat, das mit einem Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahren verkapselt war.

Abstract

Der Bottom-up-Montageansatz für den Aufbau synthetischer Zellen ist ein effektives Werkzeug zur Isolierung und Untersuchung zellulärer Prozesse in einer Zellimittierungsumgebung. Darüber hinaus hat die Entwicklung zellfreier Expressionssysteme die Fähigkeit gezeigt, die Proteinproduktions-, Transkriptions- und Translationsprozesse (DNA-RNA-Protein) kontrolliert zu rekonstituieren und dabei die synthetische Biologie zu nutzen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Herstellung eines zellfreien Expressionssystems, einschließlich der Herstellung eines potenten bakteriellen Lysats und der Verkapselung dieses Lysats in cholesterinreichen Lipid-basierten Riesen-Unilamellar-Vesikeln (GUVs) (d.h. stabile Liposomen), um synthetische Zellen zu bilden. Das Protokoll beschreibt die Methoden zur Herstellung der Komponenten der synthetischen Zellen einschließlich der Herstellung von aktiven bakteriellen Lysaten, gefolgt von einer detaillierten schrittweisen Vorbereitung der synthetischen Zellen auf der Grundlage eines Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahrens. Diese erleichtern die Produktion von Millionen synthetischer Zellen auf einfache und erschwingliche Weise mit einer hohen Vielseitigkeit für die Herstellung verschiedener Arten von Proteinen. Die erhaltenen synthetischen Zellen können verwendet werden, um die Protein-RNA-Produktion und -Aktivität in einer isolierten Umgebung zu untersuchen, in der gerichteten Evolution, und auch als kontrollierte Plattform für die Bereitstellung von Medikamenten für die On-Demand-Produktion von therapeutischen Proteinen im Körper.

Introduction

Synthetische Zellen sind künstliche zellähnliche Teilchen, die eine oder mehrere Funktionen einer lebenden Zelle imitieren, wie z. B. die Fähigkeit, zu teilen, Membraninteraktionen zu bilden und Proteine basierend auf einem genetischen Code^1,2,3zu synthetisieren. Synthetische Zellen, die zellfreie Proteinsynthesesysteme (CFPS) umschließen, besitzen eine hohe Modularität aufgrund ihrer Fähigkeit, verschiedene Proteine und RNA-Sequenzen nach Veränderungen in der DNA-Vorlage zu produzieren. Als attraktive Alternative zu den aktuellen Ansätzen der Proteinproduktion basieren CFPS-Systeme auf Zelllysat, gereinigten Komponenten oder synthetischen Komponenten und umfassen alle Transkriptions- und Übersetzungsmaschinen, die für die Proteinsynthese erforderlich sind, wie Ribosomen, RNA-Polymerase, Aminosäuren und Energiequellen (z. B. 3-Phosphoglycerat und Adenintriphosphat)^8,4,5,6,7,9. Die Verkapselung eines CFPS-Systems in Lipidbläschen ermöglicht die einfache und effiziente Produktion von Proteinen, ohne von einer lebenden Zelle abhängig zu sein¹⁰. Darüber hinaus ermöglicht diese Plattform die Synthese von Peptiden, die in natürlichen Zellen abbauen können, Produktion von Proteinen, die toxisch für lebende Zellen sind, und modifizieren Proteine mit nicht-natürlichen Aminosäuren^11,12. Synthetische Zellen wurden als Modell für Forschungszwecke verwendet, um die minimalen Zellkomponenten zu untersuchen, die erforderlich sind, um das zelluläre Leben aus evolutionärer Perspektive zu ermöglichen^1,13. Synthetische Zellen wurden auch verwendet, um genetische Schaltung zu bauen und zu implementieren und als Modelle für gerichtete Evolution^14,15,16. Andere Studien konzentrierten sich auf die Fähigkeit synthetischer Zellen, die biologische Aktivität natürlicher Zellen nachzuahmen, mit dem Ziel, beschädigte natürliche Zellen zu ersetzen, wie Betazellen bei Patienten mit Diabetes¹⁷. Darüber hinaus veranschaulicht die Fähigkeit dieser CFPS, synthetische Zellen zu verkapseln, eine Vielzahl von therapeutischen Proteinen zu produzieren, ihr Potenzial, in den klinischen Einsatz integriert zu werden¹⁸.

Hier beschreiben wir ein Bottom-up-Labor-Skalenprotokoll (Abbildung 1) zur Herstellung von RNA- und Protein produzierenden synthetischen Zellen auf Basis eines CFPS-Systems, das in einem Lipidvesikel eingekapselt ist. Dies zeigt die mögliche Verwendung synthetischer Zellplattformen als neuartige Wirkstoffabgabesysteme für die Vor-Ort-Produktion eines therapeutischen Proteinmedikaments in vivo¹⁹. Frühere Studien haben die Optimierung der CFPS-Reaktion und der Zelllysatpräparationsprozesse^4,8,20untersucht. Darüber hinaus wurden verschiedene Techniken für die zellgroße Liposomenpräparation angewendet, wie mikrofluidische und polymerbasierte Tröpfchenstabilisierungsmethoden^21,22,23, die sich auch in der Lipidzusammensetzung der Liposomen^24,25,26unterscheiden. Im vorgestellten Protokoll werden synthetische Zellen nach einem Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahren hergestellt und der Verkapselungsprozess bei niedrigen Temperaturen (<4 °C)^{5,10,24,27,28}durchgeführt. Diese milden Bedingungen haben sich als günstig für die Beibehaltung der biofunktionellen Integrität der molekularen Maschinerie erwiesen, nämlich Ribosomen und Proteine^27,29,30. Die Lipidzusammensetzung der Partikel besteht sowohl aus Cholesterin als auch aus 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (POPC). Die erste findet sich in allen Säugetierzellmembranen und ist wesentlich für die Stabilität, Steifigkeit und Durchlässigkeit der Membran, und letztere imitiert Säugetier Phospholipid Zusammensetzung^11,13. Die zelluläre Transkription und Translation molekulare Maschinerie werden aus dem BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) Stamm extrahiert, der mit pAR1219 Plasmid überexzierende T7-RNA-Polymerase umgewandelt wird, um die CFPS-Potenz und Proteinsynthese zu erhöhen. Dieses System wurde zur Herstellung diagnostischer und therapeutischer Proteine mit Molekulargewichten von bis zu 66 kDa in vitro und in vivo^19,31verwendet. Das folgende Protokoll bietet eine einfache und effektive Methode zur Herstellung des synthetischen Zellsystems, die eine Vielzahl grundlegender Fragen im Zusammenhang mit der Proteinsynthese in der Natur angehen und auch für Arzneimittelabgabeanwendungen eingesetzt werden kann.

Protocol

ANMERKUNG: Abbildung des vollständigen Produktionsprotokolls der synthetischen Zellen ist in Abbildung 1dargestellt. Je nach Bedarf des Anwenders können die Proteinexpression (Abschnitt 3.2) und die synthetische Zellbildung (Abschnitt 4) Teile des Protokolls auch unabhängig (mit einigen Anpassungen) durchgeführt werden. 1. Herstellung von S30-T7-Lysat Streifenplatte die E. coli BL21(DE3) Bakterien transformiert mit der T7 RNA Polymerase exze…

Representative Results

Wir präsentieren ein Protokoll zur Herstellung synthetischer Zellen, indem wir ein S30-T7 CFPS-System auf Basis von BL21 E. coli in Lipidbläschen verkapseln. Eine schematische Beschreibung des Vorbereitungsprozesses, die ein Bild der einzelnen Stufen enthält, ist in Abbildung 2dargestellt. Der Erfolg des synthetischen Zellvorbereitungsprozesses hängt von der entsprechenden Leistung der einzelnen Stufen ab und wird durch unterschiedliche Parameter bewirkt. Das Protokoll sollte an…

Discussion

Mit diesem Protokoll wird eine einfache und erschwingliche Methode zur Herstellung großer Mengen proteinproduzierender synthetischer Zellen eingeführt. Die Ausbeute aktiver Zellen hängt von einer sorgfältigen und genauen Ausführung des Protokolls ab, wobei der Schwerpunkt auf mehreren kritischen Schritten liegt. Im Lysatpräparat dieser Methode ist es wichtig, die entsprechende Bakteriendichte vor der Zelllyse zu erreichen, um eine ausreichende Menge an Proteinen im bakteriellen Lysat zu erreichen. Zweitens sollte d…

Materials

A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)
E.coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	E.coli BL21 (DE3).
pAR1219	Sigma	T2076	TargeTron vector for transformation.
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin	Sigma	A9518	Stored at -20 °C.
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
15 g/L Agar agar purified	Merck	1.01614.5007
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
12 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).
24 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
4% (v/v) Glycerol anhydrous	Bio-Lab	7120501
2.32 g/L K2HPO4	Spectrum chemical	P1383
12.54 g/L KH2PO4	Spectrum chemical	P1380
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)	TCI	D1071	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4	Sigma	T1503	S30 lysate buffer (1.5 L)
14 mM magnesium acetate	Merck	1.05819.0250
60 mM potassium acetate	Carlo Erba	470147
1 mM DTT	TCI	D1071
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Equipment required for step 1
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks	Thermo Scientific	50-154-2846	2 flasks
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles	KIMAX-KIMBLE	25630	2 flasks
Floor incubator shaker	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g.     * Pre-cooled to 4 °C.
High pressure homogenizer	AVESTIN	EmulsiFlex-C3	Pre-cooled to 4 °C.
-80oC freezer	SO-LOW	U85-18
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Spectrophotometer	TECAN	IN-MNANO	Infinite M200 pro
96-well transparent plate	Thermo Scientific	167008
Sterilized graduated cylinder	Corning
Sterilized centrifuge tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Sterilized pipette tips	Corning		Preferably pre-cooled to -20 °C.
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
Small liquid nitrogen tank	NALGENE	4150-4000
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Lipoid	556400	Powder
Cholesterol	Sigma	C8667	Powder
Chloroform	Bio-Lab	3082301
Mineral oil	Sigma	M5904	Light oil
Equipment required for step 2
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Heating block	TECHNE	FDB03AD	Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature.
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232	For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.
9mm Screw Cap	CSI Analytical Innovations	C395R-09LC
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):
HEPES	Spectrum	H1089	1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer
Potassium hydroxide (KOH)	Frutarom	55290
1 M Magnesium acetate	Merck	1.05819.0250	Co-factor and negative charge stabilizor.
1 M Potassium acetate	Carlo Erba	470147	Negative charge stabilizor.
5.2 M Ammonium acetate	Merck	1.01116.1000	Stabilizes negative charge.
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)	Merck	8.07491.1000	Increases the concentration of the macromolecules.
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)	Sigma	P8877	Secondary energy source.
50 mM Amino acids mixture I	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17  natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.
50 mM Amino acids mixture II	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.
100 mM Adenine triphosphate (ATP)	Sigma	A3377	Nucleotides & energy source.
50 mM Guanidine triphosphate (GTP)	Sigma	G8877	Nucleotides & energy source.
100 mM Uridine triphosphate (UTP)	ACROS ORGANICS	226310010	Nucleotides additive.
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Genes expression induction.
2 M Sucrose	J.T. Baker	1933078	Generating a density gradient.
2 M Glucose	Sigma	16301	Generating a density gradient.
H2O UltraPure Water (UPW)	Bio-Lab	2321777500	DNase & RNase free
S30-T7 lysate	_	_	Prepared at step 1.                                                                        Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage.
Stock of DNA plasmid of choice	_	_	Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)
Floor incubator shaker or Thermomixer	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
	PHMT Grant Bio	PSC18	Thermomixer
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C.
Table centrifuge	Thermo Scientific	75002420	(75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C.
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232
Sterile 15 mL plastic tubes	Thermo Scientific	339651
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086
Sterilized pipette tips	Corning		Sterilized by autoclave.