הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השיטה, חומרים, ציוד ושלבים עבור הכנת מלמטה למעלה של RNA וחלבון הפקת תאים סינתטיים. התא הפנימי מימית של התאים הסינתטיים הכיל S30 ליפוסט חיידקי כדורית בתוך bilayer ליפיד (כלומר, ליפוזומים יציבים), באמצעות העברת תחליב המים בשמן שיטה.

Abstract

גישת ההרכבה מלמטה-למעלה לבניית תאים סינתטיים היא כלי יעיל לבידוד ולחקירת תהליכים סלולאריים בסביבה תא מחקה. יתר על כן, הפיתוח של מערכות ביטויים ללא תא הפגינו את היכולת ליצור מחדש את ייצור החלבון, שעתוק ותהליכי תרגום (DNA → RNA ← חלבון) באופן מבוקר, רתימת ביולוגיה סינתטית. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת מערכת ביטוי ללא תא, כולל הייצור של ליפוסט בקטריאלי חזק ו encapsulating זה ליפוסט בתוך כולסטרול עשיר מבוסס השומנים ענק unilamellar שלפוחיות (GUVs) (כלומר, ליפוזומים יציבים), כדי ליצור תאים סינתטיים. הפרוטוקול מתאר את השיטות להכנת הרכיבים של התאים הסינתטיים, כולל ייצור ליטים חיידקיים פעילים, ואחריו הכנה מפורטת של שלב אחר שלב של התאים הסינתטיים המבוססים על שיטת העברת אמולסיה בשמן מים. אלה מקלים על ייצור מיליוני תאים סינתטיים באופן פשוט ובמחיר נוח עם רב-תכליתיות גבוהה להפקת סוגים שונים של חלבונים. התאים הסינתטיים המתקבלים ניתן להשתמש כדי לחקור את הייצור של חלבון/RNA ופעילות בסביבה מבודדת, האבולוציה מכוונת, וגם כפלטפורמת משלוח סמים מבוקרת לייצור על פי דרישה של חלבונים טיפוליים בתוך הגוף.

Introduction

תאים סינתטיים הם חלקיקים כמו תא מלאכותי, מחקה פונקציות אחת או מרובות של תא חי, כגון היכולת לחלק, אינטראקציה ממברנה טופס, ולסנתז חלבונים על בסיס קוד גנטי^1,2,3. תאים סינתטיים התוחמים את התאים ללא חלבון סינתזה (CFPS) מערכות בעלי מודולריות גבוהים בשל יכולתם לייצר חלבונים שונים רצפי RNA לאחר שינויים בתבנית ה-DNA. הצגת חלופה אטרקטיבית לגישות הנוכחיות של ייצור החלבון, מערכות cfps מבוססות על תאי ליפוסט, רכיבים מטוהרים או רכיבים סינתטיים וכוללים את כל מכונות התמלול והתרגום הדרושות לסינתזה חלבונים כגון ריבוזומים, RNA פולימראז, חומצות אמינו ומקורות אנרגיה (למשל, 3-פוספוליגליט ואדלין טריפוספט)^4,5,6,7,8,9. האנקפסולציה של מערכת CFPS בתוך שלפוחיות השומנים מאפשר ייצור פשוט ויעיל של חלבונים ללא תלות תא חי¹⁰. יתר על כן, פלטפורמה זו מאפשרת סינתזה של פפטידים שעלולים לבזות בתוך תאים טבעיים, ייצור של חלבונים רעילים לתאים חיים, ולשנות חלבונים עם חומצות אמינו לא טבעיות^11,12. תאים סינתטיים שימשו כמודל למטרות מחקר החוקרים את רכיבי התא המינימלי הנדרש כדי לאפשר את החיים הסלולריים מנקודת מבט אבולוציונית^1,13. תאים סינתטיים גם שימשו כדי לבנות וליישם מעגל גנטי וכמודלים עבור אבולוציה מכוונת^14,15,16. מחקרים אחרים התמקדו ביכולת של תאים סינתטיים לחקות את הפעילות הביולוגית של תאים טבעיים, במטרה להחליף תאים טבעיים פגומים, כגון תאים ביתא בחולים עם סוכרת¹⁷. יתר על כן, היכולת של אלה CFPS encapsulating תאים סינתטיים כדי לייצר מגוון של חלבונים טיפוליים ממחיש את הפוטנציאל שלה להיות שולבו לשימוש קליני¹⁸.

כאן אנו מתארים מלמטה-up פרוטוקול בקנה מידה (איור 1) לייצור של רנ א ו חלבון להפקת תאים סינתטיים מבוסס על מערכת cfps מקומסת ב vesicle השומנים. זה מראה את השימוש הפוטנציאלי של פלטפורמות תאים סינתטיים כמו מערכות משלוח התרופה הרומן לייצור באתר של תרופה לחלבון טיפולית ב vivo¹⁹. מחקרים קודמים חקרו את האופטימיזציה של התגובה cfps ואת תהליכי ההכנה של התא ליפוסט^4,8,20. יתר על כן, טכניקות מספר הוחלו עבור ליפוכי תא בגודל הכנה, כגון microflu, מבוססי פולימר שיטות ייצוב מבוסס droplet^21,22,23, אשר גם שונים ליפוזומים ‘ הרכב השומנים^24,25,26. בפרוטוקול המוצג, תאים סינתטיים מיוצרים באמצעות שיטת העברת אמולסיה בשמן מים ותהליך עטיפת האנקפסולציה מבוצע בטמפרטורות נמוכות (< 4 ° c)^{5,10,24,27,28}. תנאים אלה מתון נמצאו חיוביות עבור שמירה על היושרה הביו תפקודית של המכונות המולקולריות, כלומר ריבוזומים וחלבונים^27,29,30. הרכב השומנים של החלקיקים מורכב הן של כולסטרול והן 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-לגליקו-3-פוספולולין (POPC). הראשון נמצא בכל ממברנות התא של היונקים, והוא חיוני עבור יציבות, קשיחות וחדירות הפחתת הקרום, ואת האחרון מחקה ממגלית פוספוליפיד הרכב^11,13. תמלול ותרגום מכונות מולקולריות של הסלולר מופקים BL21 (DE3) es, מאמץ קולי (E. coli) זן, אשר הופך עם pAR1219 פלמביטוי יתר T7 RNA פולימראז כדי להגדיל את העוצמה cfps וסינתזה חלבון. מערכת זו שימש כדי לייצר חלבונים אבחון וטיפולי, עם משקולות מולקולרים של עד 66 kda ב מבחנה ב vivo^19,31. הפרוטוקול הבא מספק שיטה פשוטה ואפקטיבית לייצור מערכת התאים הסינתטית, שיכולה לענות על מגוון רחב של שאלות עקרוניות הקשורות לסינתזה החלבונים בטבע ויכולה לשמש גם ליישומים של משלוחי סמים.

Protocol

הערה: האיור המלא של פרוטוקול הייצור של התאים הסינתטיים מוצג באיור 1. על פי צורכי המשתמש, ביטוי החלבון (סעיף 3.2) והיווצרות תאים סינתטיים (סעיף 4) חלקים מהפרוטוקול יכול להתבצע גם באופן עצמאי (עם כמה עיבודים). 1. הכנת S30-T7 ליפוסט פס הצלחת ה -E. coli BL21 (DE3) חיידקי…

Representative Results

אנו מציגים פרוטוקול להכנת תאים סינתטיים על-ידי encapsulating S30-T7 CFPS מערכת מבוסס על BL21 E. coli בתוך שלפוחית השומנים. תיאור סכמטי של תהליך ההכנה הכולל תמונה של כל שלב מוצג באיור 2. הצלחת תהליך ההכנה של התא הסינתטי תלויה בביצועים המתאימים של כל שלב ומושפע מפרמטרים שונים. הפרוטוקול ?…

Discussion

פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה ובמחיר נוח לייצור כמויות גדולות של תאים סינתטיים המייצרים חלבונים. התשואה של תאים פעילים תלויה בביצוע קפדני ומדויק של הפרוטוקול עם דגש על מספר שלבים קריטיים. בסעיף ההכנה ליפוסט של שיטה זו, חיוני להגיע לצפיפות החיידקים המתאימה לפני הפירוק התאים כדי להשיג כמות מ?…

Materials

A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)
E.coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	E.coli BL21 (DE3).
pAR1219	Sigma	T2076	TargeTron vector for transformation.
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin	Sigma	A9518	Stored at -20 °C.
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
15 g/L Agar agar purified	Merck	1.01614.5007
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
12 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).
24 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
4% (v/v) Glycerol anhydrous	Bio-Lab	7120501
2.32 g/L K2HPO4	Spectrum chemical	P1383
12.54 g/L KH2PO4	Spectrum chemical	P1380
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)	TCI	D1071	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4	Sigma	T1503	S30 lysate buffer (1.5 L)
14 mM magnesium acetate	Merck	1.05819.0250
60 mM potassium acetate	Carlo Erba	470147
1 mM DTT	TCI	D1071
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Equipment required for step 1
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks	Thermo Scientific	50-154-2846	2 flasks
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles	KIMAX-KIMBLE	25630	2 flasks
Floor incubator shaker	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g.     * Pre-cooled to 4 °C.
High pressure homogenizer	AVESTIN	EmulsiFlex-C3	Pre-cooled to 4 °C.
-80oC freezer	SO-LOW	U85-18
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Spectrophotometer	TECAN	IN-MNANO	Infinite M200 pro
96-well transparent plate	Thermo Scientific	167008
Sterilized graduated cylinder	Corning
Sterilized centrifuge tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Sterilized pipette tips	Corning		Preferably pre-cooled to -20 °C.
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
Small liquid nitrogen tank	NALGENE	4150-4000
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Lipoid	556400	Powder
Cholesterol	Sigma	C8667	Powder
Chloroform	Bio-Lab	3082301
Mineral oil	Sigma	M5904	Light oil
Equipment required for step 2
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Heating block	TECHNE	FDB03AD	Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature.
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232	For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.
9mm Screw Cap	CSI Analytical Innovations	C395R-09LC
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):
HEPES	Spectrum	H1089	1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer
Potassium hydroxide (KOH)	Frutarom	55290
1 M Magnesium acetate	Merck	1.05819.0250	Co-factor and negative charge stabilizor.
1 M Potassium acetate	Carlo Erba	470147	Negative charge stabilizor.
5.2 M Ammonium acetate	Merck	1.01116.1000	Stabilizes negative charge.
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)	Merck	8.07491.1000	Increases the concentration of the macromolecules.
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)	Sigma	P8877	Secondary energy source.
50 mM Amino acids mixture I	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17  natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.
50 mM Amino acids mixture II	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.
100 mM Adenine triphosphate (ATP)	Sigma	A3377	Nucleotides & energy source.
50 mM Guanidine triphosphate (GTP)	Sigma	G8877	Nucleotides & energy source.
100 mM Uridine triphosphate (UTP)	ACROS ORGANICS	226310010	Nucleotides additive.
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Genes expression induction.
2 M Sucrose	J.T. Baker	1933078	Generating a density gradient.
2 M Glucose	Sigma	16301	Generating a density gradient.
H2O UltraPure Water (UPW)	Bio-Lab	2321777500	DNase & RNase free
S30-T7 lysate	_	_	Prepared at step 1.                                                                        Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage.
Stock of DNA plasmid of choice	_	_	Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)
Floor incubator shaker or Thermomixer	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
	PHMT Grant Bio	PSC18	Thermomixer
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C.
Table centrifuge	Thermo Scientific	75002420	(75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C.
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232
Sterile 15 mL plastic tubes	Thermo Scientific	339651
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086
Sterilized pipette tips	Corning		Sterilized by autoclave.