العزلة، وTransfection، والثقافة طويلة الأجل من الماوس الكبار والجرذان Cardiomyocytes
Summary
هنا، نقدم بروتوكولاً للعزلة، وtransfection، والثقافة طويلة الأجل من الماوس الكبار والجرذان cardiomyocytes.
Abstract
السابقين فيفو ثقافة من الثدييات الكبار cardiomyocytes (CMs) يقدم النظام التجريبي الأكثر صلة للدراسة في المختبر من بيولوجيا القلب. إنّ تقانات الثدييات البالغة هي خلايا متمايزة بشكل نهائي ذات قدرة تكاثرية دنيا. لا تحد حالة ما بعد الميتكت من CMs الكبار من تقدم دورة خلايا القلب العضلي القلب فحسب، بل تحد أيضًا من ثقافة CMs الفعالة. وعلاوة على ذلك، فإن الثقافة الطويلة الأجل للبالغين من أجل إجراء دراسات كثيرة، مثل انتشار الـ CM وتحليل التعبير الجيني.
الفأر والفئران هما الأكثر تفضيلا الحيوانات المختبرية لاستخدامها في عزل cardiomyocyte. وفي حين أن الثقافة الطويلة الأجل لـ CMs الفئران ممكنة، فإن الماوس البالغ عرضة للموت ولا يمكن استزراعه أكثر من خمسة أيام في ظل الظروف العادية. ولذلك، هناك حاجة ماسة لتحسين عزل الخلية وبروتوكول الثقافة طويلة الأجل للبالغين مورين CMs. مع هذا البروتوكول المعدلة، فمن الممكن لعزل وثقافة كل من الماوس الكبار و CMs الفئران لأكثر من 20 يوما. وعلاوة على ذلك، فإن كفاءة نقل الـ(سيرنا) لـ CM المعزولة تزداد بشكل كبير مقارنة بالتقارير السابقة. لعزلة CM الماوس الكبار، يتم استخدام طريقة التحلل Langendorff مع حل انزيم الأمثل والوقت الكافي للتفكك المصفوفة خارج الخلية كاملة. من أجل الحصول على CMs البطين النقي ، تم تشريح كل من الأذينين والتخلص منه قبل الشروع في فصل وطلاء. وتفرقت الخلايا على لوحة مغلفة باللفين، مما سمح بتعلقها بكفاءة وسرعة. سُمح لـ CMs بتسوية 4-6 ساعات قبل نقل سيرنا. تم تحديث وسائل الإعلام الثقافة كل 24 ساعة لمدة 20 يوما، وبعد ذلك، تم إصلاح CMs وملطخة لعلامات القلب محددة مثل Troponin وعلامات دورة الخلية مثل KI67.
Introduction
أمراض القلب هي واحدة من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم. تقريبا جميع أنواع الإصابة القلبية يؤدي إلى فقدان كبير من أمراض القلب الكبار (CMs). قلوب الثدييات الكبار غير قادرين على إصلاح إصابات القلب بسبب الطبيعة الشيخوخة لـ CM البالغ1. وبالتالي، فإن أي إهانة للقلب الثديي البالغين يؤدي إلى فقدان دائم لـ CMs، مما يؤدي إلى انخفاض وظيفة القلب وفشل القلب. على عكس الثدييات الكبار، يمكن للحيوانات الصغيرة مثل حمار وحشي وقلوب نيوت تجديد إصابات القلب من خلال انتشار CM القائمة2،3،4. ويجري بذل جهد عالمي لإيجاد تدخل علاجي جديد للإصابة بالقلب من خلال النهج التكاثرية وغير التكاثرية على حد سواء. في العقود الماضية، تم تطوير أنواع مختلفة من نماذج الماوس الجينية لدراسة إصابة القلب وإصلاح. ومع ذلك، فإن استخدام نماذج الحيوانات الحية في أن يكون نهجا مكلفا مع تعقيد إضافي لفك آلية الخلية المستقلة من الآثار الثانوية. إلى جانب ذلك، في نظم الجسم الحي هي صعبة لتحليل CM آثار محددة للتدخل الدوائية التي تحفز إشارات القلب من CM.
وعلاوة على ذلك، فإن الثقافة الطويلة الأجل للأجهزة الجماعية للبالغين ضرورية لإجراء تحليلات انتشار الأسلحة العنقودية. تتطلب فحوصات انتشار CM ما لا يقل عن 4-5 أيام حتى يتم تحريض الخلايا في دورة الخلية والحصول على بيانات دقيقة بعد ذلك. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الدراسات التي تستخدم CMs المعزولة للدراسات الفسيولوجية الكهربائية ، وفحص الأدوية ، ودراسات السمية ، ودراسات Ca++ التوازن كلها في حاجة إلى نظام ثقافة محسن5،6،7. وعلاوة على ذلك، تظهر الدراسات الحديثة أهمية القلبية من السيتوكينات يفرز من CMs (cardiokines)8،9. من أجل التحقيق في الدور العلاجي والآلية الجزيئية لهذه القلب أثناء إصلاح القلب وتجديده ، هناك حاجة إلى ثقافة طويلة.
الكبار الجرذان CMs قوية بما فيه الكفاية لعزلة خلية واحدة والثقافة على المدى الطويل في نظام في المختبر10،11،12. ومع ذلك ، فإن الماوس الكبار CMs هي ذات أهمية كبيرة في المختبرات ، وذلك بسبب توافر مجموعة متنوعة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا ، والذي يسمح لتصميم وتنفيذ مختلف التحليلات المبتكرة التي لا يمكن مع الفئران CM13. على النقيض من الكبار الجرذان CM العزلة ، فإنه من الصعب جدا الحصول على تعليق خلية واحدة من قلوب الماوس الكبار ، وثقافة طويلة الأجل من الكبار الماوس CMs في الثقافة هو أكثر تحديا.
الكبار CM العزلة من قلوب الفئران والماوس باستخدام نظام Langendorff سبق أن أنشئت لدراسة وظيفة CM5،14،15. هنا، وصفنا بالتفصيل بروتوكولات لعزلة CM الكبار عن كل من الفئران والجرذان، فضلا عن الثقافة المعدلة على المدى الطويل، وتكاثر تكاثر CM للخلايا المعزولة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك حاجة ماسة إلى إنشاء بروتوكول لعزلة القلب و الثقافة طويلة الأجل لإجراء دراسات ميكانيكية خاصة بالخلايا. هناك فقط عدد قليل من التقارير التي تناقش الكبار CM بروتوكولات العزل، وتستخدم أقل منهم حتى لثقافة طويلة الأجل من الفئران الكبار CM15،16،17…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من خلال تمويل من قسم علم الأمراض والطب المختبري، جامعة سينسيناتي، كلية الطب، إلى الدكتور أونور كانيسيك؛ منحة من المعاهد الوطنية للصحة (R01HL148598) إلى الدكتور أونور كانيسيك. الدكتور أونور كانيسيكاك مدعوم من قبل جمعية القلب الأمريكية جائزة التطوير الوظيفي (18CDA34110117). الدكتور بيرويز علم مدعوم من قبل جمعية القلب الأمريكية منحة ما بعد الدكتوراه (AHA_20POST35200267). الدكتورة مالينا ج. آيفي مدعومة بمنحة من المعاهد القومية للصحة T32 (HL 125204-06A1).
Materials
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
Referencias
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8, 53748 (2013).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138, 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).
- Brette, F., Orchard, C. T-tubule function in mammalian cardiac myocytes. Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).
- Zhou, H., et al. Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).
- Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental. BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).
- Alam, P., et al. Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).
- Arif, M., et al. MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119, 909-920 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).
- O’Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).
- Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, 305-313 (1994).
