Isolamento, trasfezione e cultura a lungo termine di cardiomiociti per topi e ratti adulti
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per l’isolamento, la trasfezione e la cultura a lungo termine dei cardiomiociti adulti di topi e ratti.
Abstract
La coltura ex vivo dei cardiomiociti di mammiferi adulti (CM) presenta il sistema sperimentale più rilevante per lo studio in vitro della biologia cardiaca. I VM di mammiferi adulti sono cellule terminalmente differenziate con capacità proliferative minima. Lo stato post-mitotico dei VM adulti non solo limita la progressione del ciclo cellulare cardiomiocato, ma limita anche la coltura efficiente delle CM. Inoltre, la cultura a lungo termine delle CCI adulte è necessaria per molti studi, come la proliferazione CM e l’analisi dell’espressione genica.
Il topo e il ratto sono i due animali da laboratorio preferiti da utilizzare per l’isolamento cardiomiocato. Mentre la cultura a lungo termine dei CCI ratti è possibile, i VM per topi adulti sono suscettibili alla morte e non possono essere sevati più di cinque giorni in condizioni normali. Pertanto, vi è una necessità critica di ottimizzare l’isolamento delle cellule e il protocollo di coltura a lungo termine per le CCI murine adulte. Con questo protocollo modificato, è possibile isolare con successo e coltura sia per topi adulti e ratto CMs per più di 20 giorni. Inoltre, l’efficienza della trasfezione del siRNA di CM isolato è significativamente aumentata rispetto ai rapporti precedenti. Per l’isolamento CM del topo adulto, il metodo di perfusione Diatrofio viene utilizzato con una soluzione enzimatica ottimale e con tempo sufficiente per la completa dissociazione della matrice extracellulare. Al fine di ottenere CM ventricolari puri, entrambi gli attri sono stati sezionati e scartati prima di procedere con la dissociazione e la placcatura. Le cellule sono state disperse su una piastra rivestita di laminina, che ha permesso un attaccamento efficiente e rapido. I VM sono stati autorizzati ad accontentarsi di 4-6 h prima della trasfezione del siRNA. I supporti di coltura sono stati aggiornati ogni 24 h per 20 giorni, e successivamente, i CM sono stati fissati e macchiati per marcatori cardiaci specifici come La troponina e marcatori del ciclo cellulare come KI67.
Introduction
Le malattie cardiache sono una delle principali cause di morte in tutto il mondo. Quasi tutti i tipi di lesioni cardiache si tras danno una significativa perdita di cardiomiociti adulti (CM). I cuori dei mammiferi adulti non sono in grado di riparare le loro lesioni cardiache a causa della natura senescente del CM1 adulto. Così, qualsiasi insulto al cuore dei mammiferi adulti si traduce in una perdita permanente di CMs, che porta a una ridotta funzione cardiaca e insufficienza cardiaca. A differenza dei mammiferi adulti, piccoli animali come il pesce zebra e i cuori di nuovatta possono rigenerare le loro lesioni cardiache attraverso la proliferazione CMesistente 2,3,4. È in corso uno sforzo mondiale per trovare un nuovo intervento terapeutico per le lesioni cardiache tramite approcci prolifertivi e non proliferative. Negli ultimi decenni, sono stati sviluppati vari tipi di modelli genetici di topo per studiare le lesioni cardiache e la riparazione. Tuttavia, l’utilizzo di modelli animali in vivo continua ad essere un approccio costoso con l’ulteriore complessità per decifrare un meccanismo autonomo dalle cellule dagli effetti secondari. Inoltre, i sistemi in vivo sono difficili da analizzare CM effetti specifici di un intervento farmacologico che induce la segnalazione cardioprotettiva dal CM.
Inoltre, la cultura a lungo termine delle CCI adulte è necessaria per eseguire analisi di proliferazione cm. I saggi di proliferazione CM richiedono un minimo di 4-5 giorni affinché le cellule siano indotte nel ciclo cellulare e per ottenere dati accurati dopo di che. Inoltre, gli studi che utilizzano cM isolati per studi elettrofisiologici, screening farmacologici, studidi tossicità e studi sull’omeostasi di Ca sono tutti bisognosi di un sistema dicoltura migliorato 5,6,7. Inoltre, studi recenti mostrano il significato cardioprotettivo delle citochine secrete dai CMs (cardiocine)8,9. Al fine di studiare il ruolo terapeutico e il meccanismo molecolare di queste cardiochine durante la riparazione e la rigenerazione del cuore, è necessaria una coltura prolungata.
Le CCI ratto adulte sono sufficientemente robuste per l’isolamento a una cellula e la coltura a lungo termine in un sistema in vitro10,11,12. Tuttavia, i CIM per topi adulti sono di grande interesse per gli analisi in vitro, a causa della disponibilità di una varietà di modelli murini geneticamente modificati, che consente la progettazione e l’esecuzione di varie analisi innovative che non sono possibili con il ratto CM13. A differenza dell’isolamento CM del ratto adulto, è piuttosto difficile ottenere una sospensione a un solo cellula dai cuori dei topi adulti, e la cultura a lungo termine delle VM per topi adulti nella cultura è ancora più impegnativa.
L’isolamento CM adulto dai cuori di topo e ratto utilizzando un sistema Langendorff è stato precedentemente stabilito per studiare la funzione CM5,14,15. Qui, abbiamo descritto in dettaglio i protocolli per l’isolamento CM adulto da ratti e topi, così come una coltura a lungo termine modificata, la trasfezione e la proliferazione CM di cellule isolate.
Protocol
Representative Results
Discussion
C’è una necessità fondamentale di stabilire un protocollo per l’isolamento dei cardiomiocisti adulti e la coltura a lungo termine per eseguire studi meccanicistici specifici delle cellule. Ci sono solo pochi rapporti che parlano di protocolli di isolamento CM adulti, e ancora meno di loro sono utilizzati per la coltura a lungo termine di topi adulti CM15,16,17. È stato dimostrato che il ratto adulto CM ha una maggiore tollera…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal finanziamento del Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, Università di Cincinnati, College of Medicine, al Dr. Onur Kanisicak; una sovvenzione del National Institutes of Health (R01HL148598) al Dr. Onur Kanisicak. Il Dr. Onur Kanisicak è supportato dall’American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Dr. Perwez Alam è supportato dalla sovvenzione post-dottorato American Heart Association (AHA_20POST35200267). La dott.ssa Malina J. Ivey è supportata da una sovvenzione NIH T32 (HL 125204-06A1).
Materials
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
Referencias
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