Isolation, transfection et culture à long terme des cardiomyocytes adultes de souris et de rats
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement, la transfection, et la culture à long terme de la souris adulte et les cardiomyocytes de rat.
Abstract
La culture ex vivo des cardiomyocytes mammifères adultes (CM) présente le système expérimental le plus pertinent pour l’étude in vitro de la biologie cardiaque. Les CMs des mammifères adultes sont des cellules différenciées en phase terminale avec une capacité proliférative minimale. L’état post-mitotique des MCM adultes non seulement limite la progression du cycle cellulaire cardiomyocyte, mais limite également la culture efficace des CM. En outre, la culture à long terme des MC adultes est nécessaire pour de nombreuses études, telles que la prolifération cm et l’analyse de l’expression des gènes.
La souris et le rat sont les deux animaux de laboratoire les plus préférés à être utilisés pour l’isolement cardiomyocyte. Bien que la culture à long terme des CMs de rat soit possible, les CMs adultes de souris sont sensibles à la mort et ne peuvent pas être cultivés plus de cinq jours dans des conditions normales. Par conséquent, il est essentiel d’optimiser l’isolement cellulaire et le protocole de culture à long terme pour les CM murines adultes. Avec ce protocole modifié, il est possible d’isoler et de culture avec succès les CM adultes de souris et de rats pendant plus de 20 jours. De plus, l’efficacité de la transfection du SIRNA du CM isolé est considérablement augmentée par rapport aux rapports précédents. Pour l’isolement cm de souris adulte, la méthode de perfusion de Langendorff est employée avec une solution enzymatique optimale et le temps suffisant pour la dissociation complète de matrice extracellulaire. Afin d’obtenir des MC ventriculaires purs, les deux atrias ont été disséqués et jetés avant de procéder à la dissociation et au placage. Les cellules ont été dispersées sur une plaque enduite de laminine, ce qui a permis un attachement efficace et rapide. Les CM ont été autorisés à se contenter de 4-6 h avant la transfection de siRNA. Les médias culturels ont été rafraîchis tous les 24 h pendant 20 jours, et par la suite, les CM ont été fixés et tachés pour des marqueurs cardiaques spécifiques tels que la troponine et des marqueurs du cycle cellulaire tels que KI67.
Introduction
Les maladies cardiaques sont l’une des principales causes de décès dans le monde. Presque tous les types de lésions cardiaques entraînent une perte importante de cardiomyocytes adultes (CM). Les cœurs de mammifères adultes sont incapables de réparer leurs lésions cardiaques en raison de la nature sénescente du CM1adulte. Ainsi, toute insulte au cœur des mammifères adultes entraîne une perte permanente de CMs, conduisant à une diminution de la fonction cardiaque et l’insuffisance cardiaque. Contrairement aux mammifères adultes, les petits animaux comme le poisson zèbre et les cœurs de newt peuvent régénérer leurs lésions cardiaques par la prolifération existante cm2,3,4. Un effort mondial est en cours pour trouver une nouvelle intervention thérapeutique pour les lésions cardiaques par le biais d’approches prolifératives et non prolifératives. Au cours des dernières décennies, divers types de modèles génétiques de souris ont été développés pour étudier les lésions cardiaques et la réparation. Cependant, l’utilisation de modèles animaux in vivo continue d’être une approche coûteuse avec la complexité supplémentaire pour déchiffrer un mécanisme cellulaire autonome à partir d’effets secondaires. En outre, les systèmes in vivo sont difficiles à analyser les effets spécifiques cm d’une intervention pharmacologique qui induit la signalisation cardioprotectrice de la CM.
De plus, la culture à long terme des MC adultes est nécessaire pour effectuer des analyses de prolifération des CM. Les tests de prolifération cm nécessitent un minimum de 4-5 jours pour que les cellules soient induites dans le cycle cellulaire et pour obtenir des données précises par la suite. En outre, les études qui utilisent des CM isolés pour des études électrophysiologiques, le dépistage des médicaments, les études de toxicité, et les études d’homéostasie Ca++ ont tous besoin d’un système de culture amélioré5,6,7. En outre, des études récentes montrent l’importance cardioprotectrice des cytokines sécrétées par les CMs (cardiokines)8,9. Afin d’étudier le rôle thérapeutique et le mécanisme moléculaire de ces cardiokines pendant la réparation et la régénération de coeur, une culture prolongée est exigée.
Les CMs adultes de rat sont assez robustes pour l’isolement unicellulaire et la culture à long terme dans un système in vitro10,11,12. Cependant, les CM de souris adultes sont d’un grand intérêt pour les tests in vitro, en raison de la disponibilité d’une variété de modèles de souris génétiquement modifiés, ce qui permet la conception et l’exécution de diverses analyses innovantes qui ne sont pas possibles avec le rat CM13. Contrairement à l’isolement adulte de CM de rat, il est assez difficile d’obtenir une suspension d’une seule cellule des coeurs de souris adultes, et la culture à long terme des CM de souris adultes dans la culture est encore plus difficile.
L’isolement adulte de CM des coeurs de souris et de rat utilisant un système de Langendorff a précédemment été établi pour étudier la fonction de CM5,14,15. Ici, nous avons décrit en détail les protocoles pour l’isolement adulte de CM des rats et des souris, aussi bien qu’une culture modifiée à long terme, la transfection, et la prolifération de CM des cellules isolées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est essentiel d’établir un protocole pour l’isolement cardiomyocyte adulte et la culture à long terme pour effectuer des études mécanistes spécifiques aux cellules. Il n’y a que quelques rapports discutant des protocoles adultes d’isolement cm, et encore moins d’entre eux sont utilisés pour la culture à long terme des souris adultes CM15,16,17. Il est démontré que le rat adulte CM a une plus grande toléran…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été appuyé par le financement du Département de pathologie et de médecine de laboratoire de l’Université de Cincinnati, College of Medicine, au Dr Onur Kanisicak; une subvention des National Institutes of Health (R01HL148598) au Dr Onur Kanisicak. Le Dr Onur Kanisicak est soutenu par l’American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Le Dr Perwez Alam est soutenu par la subvention postdoctorale de l’American Heart Association (AHA_20POST35200267). Le Dr Malina J. Ivey est soutenu par une subvention T32 des NIH (HL 125204-06A1).
Materials
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
Referencias
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8, 53748 (2013).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138, 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).
- Brette, F., Orchard, C. T-tubule function in mammalian cardiac myocytes. Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).
- Zhou, H., et al. Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).
- Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental. BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).
- Alam, P., et al. Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).
- Arif, M., et al. MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119, 909-920 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).
- O’Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).
- Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, 305-313 (1994).
