בידוד, טרנס-תירבה ותרבות ארוכת טווח של עכבר מבוגר וקרדיומיוציטים עכברים וחולדות
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד, טרנס-תירטוי ותרבות ארוכת טווח של עכבר בוגר וקרדיומיוציטים של חולדות.
Abstract
תרבות החיים לשעבר של קרדיומיוציטים יונקים בוגרים (CMs) מציגה את המערכת הניסיונית הרלוונטית ביותר למחקר במבחנה של ביולוגיה לבבית. CMs יונקים בוגרים הם תאים מובדילים סופנית עם קיבולת התפשטות מינימלית. המצב שלאחר המיטוטיקה של CMs למבוגרים לא רק מגביל את התקדמות מחזור תא cardiomyocyte, אלא גם מגביל את התרבות היעילה של CMs. יתר על כן, התרבות ארוכת הטווח של CMs למבוגרים היא הכרחית עבור מחקרים רבים, כגון התפשטות CM וניתוח של ביטוי גנים.
העכבר והעכברוש הם שתי חיות המעבדה המועדפות ביותר שישמשו לבידוד קרדיומיוציט. בעוד התרבות ארוכת הטווח של CMs חולדה אפשרית, CMs עכבר מבוגר רגישים למוות ולא ניתן לתרע יותר מחמישה ימים בתנאים נורמליים. לכן, יש צורך קריטי לייעל את בידוד התא ואת פרוטוקול תרבות לטווח ארוך עבור CMs murine למבוגרים. עם פרוטוקול זה שונה, ניתן לבודד בהצלחה ותרבות הן עכבר בוגר ועכברוש CMs במשך יותר מ 20 ימים. יתר על כן, יעילות הטרנס-תום-רוחב של סי.אם מבודד גדלה באופן משמעותי בהשוואה לדוחות קודמים. עבור בידוד CM עכבר מבוגר, שיטת perfusion Langendorff מנוצל עם פתרון אנזים אופטימלי ומספיק זמן עבור דיסוציאציה מטריצה extracellular מלא. על מנת להשיג CMs חדרי טהור, שני atria נותקו והושלכו לפני שהמשיך עם ההתנתקות והציפוי. התאים פוזרו על צלחת מצופה למימינין, מה שאפשר חיבור יעיל ומהיר. CMs הורשו להסתפק 4-6 שעות לפני תירגם siRNA. מדיה תרבות היה רענן כל 24 שעות במשך 20 ימים, ולאחר מכן, CMs היו קבועים ומוכתמים עבור סמנים ספציפיים לב כגון טרופונין סמנים של מחזור תא כגון KI67.
Introduction
מחלות לב הן אחת הסיבות המובילות למוות ברחבי העולם. כמעט כל סוגי פגיעת לב לגרום לאובדן משמעותי של cardiomyocytes למבוגרים (CMs). לבבות יונקים בוגרים אינם מסוגלים לתקן את פציעת הלב שלהם בשל אופיו הרגיש של CM1 הבוגר. לכן, כל עלבון ללב היונקים הבוגרים גורם לאובדן קבוע של CMs, המוביל לתפקוד לב מופחת ואי ספיקת לב. שלא כמו יונקים בוגרים, בעלי חיים קטנים כמו דגי זברה ולבבות ניוט יכולים לחדש את פגיעת הלב שלהםבאמצעות התפשטותCM קיימת 2,3,4. מאמץ עולמי הוא מתמשך למצוא התערבות טיפולית חדשנית עבור פגיעה לב באמצעות גישות הן proliferative ולא התפשטות. בעשורים האחרונים פותחו סוגים שונים של מודלים של עכברים גנטיים כדי ללמוד פגיעה ותיקון לב. עם זאת, השימוש במודלים של בעלי חיים vivo ממשיך להיות גישה יקרה עם המורכבות הנוספת כדי לפענח מנגנון תא אוטונומי מאפקטים משניים. חוץ מזה, במערכות vivo מאתגרים לנתח CM השפעות ספציפיות של התערבות תרופתית הגורם איתות cardioprotective מן CM.
יתר על כן, התרבות ארוכת הטווח של CMs למבוגרים יש צורך לבצע ניתוחי התפשטות CM. CM התפשטות assays דורשים מינימום של 4-5 ימים עבור תאים להיות מושרה לתוך מחזור התא ולקבל נתונים מדויקים לאחר מכן. בנוסף, מחקרים המשתמשים CMs מבודדים עבור מחקרים אלקטרופיזיולוגיים, סינון סמים, מחקרי רעילות, ו Ca++ מחקרי הומסטאזיס כולם זקוקים למערכת תרבות משופרת5,6,7. יתר על כן, מחקרים אחרונים מראים את המשמעות cardioprotective של ציטוקינות הפרשת CMs (cardiokines)8,,9. על מנת לחקור את התפקיד הטיפולי ואת המנגנון המולקולרי של קרדיוקין אלה במהלך תיקון לב והתחדשות, נדרשת תרבות ממושכת.
מלשינים של חולדות בוגרות חזקים מספיק לבידוד חד-תאי ולתרבות ארוכת טווחבמערכת חוץ-חוץ-10,,11,,12. עם זאת, CMs עכבר מבוגר הם עניין רב עבור חוץ חוץ, בשל הזמינות של מגוון רחב של מודלים עכבר מהונדסים גנטית, המאפשר עיצוב וביצוע של ניתוחים חדשניים שונים שאינם אפשריים עם חולדה CM13. בניגוד לבידוד CM חולדה למבוגרים, זה די מאתגר לקבל השעיה חד-תאית מלבבות עכבר מבוגר, ואת התרבות לטווח ארוך של CMs עכבר מבוגר בתרבות הוא אפילו יותר מאתגר.
בידוד CM למבוגרים מלבבות עכבר וחולדות באמצעות מערכת Langendorff הוקמה בעבר כדי ללמוד CMפונקציה 5,14,15. כאן, תיארנו בפירוט את הפרוטוקולים לבידוד CM למבוגרים הן חולדות ועכברים, כמו גם תרבות ארוכת טווח שונה, transfection, והתפשטות CM של תאים מבודדים.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש צורך קריטי להקים פרוטוקול לבידוד cardiomyocyte למבוגרים ותרבות לטווח ארוך כדי לבצע מחקרים מכניים ספציפיים לתא. יש רק כמה דיווחים דנים פרוטוקולי בידוד CM למבוגרים, ואפילו פחות מהם משמשים לתרבות ארוכת טווח של עכברים בוגרים CM15,16,17. זה הראו כי CM ח?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהמחלקה לפתולוגיה ורפואה במעבדה, אוניברסיטת סינסינטי, המכללה לרפואה, לד”ר אונור קניסיסק; מענק מהכונים הלאומיים לבריאות (R01HL148598) לד”ר אונור קניסיקאק. ד”ר אונור קניסיקק נתמך על ידי פרס פיתוח הקריירה של איגוד הלב האמריקאי (18CDA34110117). ד”ר Perwez עלאם נתמך על ידי מענק פוסט-ת”ר של איגוד הלב האמריקאי (AHA_20POST35200267). ד”ר מלינה J. Ivey נתמך על ידי מענק NIH T32 (HL 125204-06A1).
Materials
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
Referencias
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8, 53748 (2013).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138, 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).
- Brette, F., Orchard, C. T-tubule function in mammalian cardiac myocytes. Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).
- Zhou, H., et al. Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).
- Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental. BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).
- Alam, P., et al. Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).
- Arif, M., et al. MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119, 909-920 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).
- O’Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).
- Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, 305-313 (1994).
