Isolatie, transfectie, en lange termijn cultuur van volwassen muis en rat cardiomyocyten
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de isolatie, transfectie, en de lange termijn cultuur van volwassen muis en rat cardiomyocyten.
Abstract
Ex vivo cultuur van de volwassen zoogdier cardiomyocyten (CMs) presenteert de meest relevante experimentele systeem voor de in vitro studie van cardiale biologie. Volwassen zoogdier-CMs zijn terminaal gedifferentieerde cellen met een minimale proliferative capaciteit. De post-mitotische toestand van volwassen CMs beperkt niet alleen cardiomyocyte celcyclusprogressie, maar beperkt ook de efficiënte cultuur van CMs. Bovendien is de langetermijncultuur van volwassen CMs noodzakelijk voor veel studies, zoals CM-proliferatie en analyse van genexpressie.
De muis en de rat zijn de twee meest geprefereerde proefdieren die worden gebruikt voor cardiomyocyte isolatie. Hoewel de langetermijncultuur van ratten-OEM’s mogelijk is, zijn volwassen muis-OEM’s gevoelig voor de dood en kunnen ze niet langer dan vijf dagen onder normale omstandigheden worden gekweekt. Daarom is er een kritische behoefte om de celisolatie en het langetermijncultuurprotocol voor volwassen murine-OEM’s te optimaliseren. Met dit gewijzigde protocol is het mogelijk om zowel volwassen muis- als ratten-OEM’s gedurende meer dan 20 dagen succesvol te isoleren en te verlenen. Bovendien is de siRNA transfectie-efficiëntie van geïsoleerde CM aanzienlijk toegenomen in vergelijking met eerdere rapporten. Voor de CM-isolatie van de volwassen muis wordt de Langendorff-perfusiemethode gebruikt met een optimale enzymoplossing en voldoende tijd voor volledige extracellulaire matrixdissociatie. Om zuivere ventriculaire CMs te verkrijgen, werden beide atria ontleed en weggegooid alvorens verder te gaan met de dissociatie en beplating. Cellen werden verspreid op een laminine gecoate plaat, die het mogelijk gemaakt voor een efficiënte en snelle bevestiging. CMs mochten genoegen nemen met 4-6 uur voor siRNA transfectie. Cultuur media werd vernieuwd om de 24 uur voor 20 dagen, en vervolgens, CMs werden vastgesteld en gekleurd voor cardiale-specifieke markers zoals Troponin en markers van celcyclus zoals KI67.
Introduction
Hartziekten zijn een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd. Bijna alle vormen van hartletsel resulteren in een aanzienlijk verlies van volwassen cardiomyocyten (CMs). Volwassen zoogdier harten zijn niet in staat om hun hartletsel te herstellen als gevolg van de senescente aard van de volwassen CM1. Dus, elke belediging van de volwassen zoogdierhart resulteert in een permanent verlies van CMs, wat leidt tot verminderde hartfunctie en hartfalen. In tegenstelling tot volwassen zoogdieren kunnen kleine dieren zoals zebravissen en nieuwe harten hun hartletsel regenereren door bestaande CM proliferatie2,3,4. Een wereldwijde inspanning is aan de gang om een nieuwe therapeutische interventie voor hartletsel te vinden via zowel proliferative en niet-proliferative benaderingen. In de afgelopen decennia zijn verschillende soorten genetische muismodellen ontwikkeld om hartletsel en reparatie te bestuderen. Het gebruik van in vivo diermodellen blijft echter een dure benadering met de extra complexiteit om een celautonoom mechanisme te ontcijferen aan secundaire effecten. Bovendien zijn in vivo systemen een uitdaging om CM-specifieke effecten van een farmacologische interventie te analyseren die cardioprotectieve signalering van de CM induceert.
Bovendien is de langetermijncultuur van volwassen CMs noodzakelijk om CM-proliferatieanalyses uit te voeren. CM proliferatie testen vereisen een minimum van 4-5 dagen voor cellen worden geïnduceerd in de celcyclus en om nauwkeurige gegevens te verkrijgen na dat. Bovendien, studies die gebruik maken van geïsoleerde CMs voor elektrofysiologische studies, drug screening, toxiciteit studies, en Ca++ homeostase studies zijn allemaal behoefte aan een verbeterde cultuur systeem5,6,7. Bovendien tonen recente studies de cardioprotectieve betekenis aan van cytokinen die zijn afgescheiden van CMs (cardiokines)8,9. Om de therapeutische rol en het moleculaire mechanisme van deze cardiokines tijdens hartreparatie en regeneratie te onderzoeken, is een langdurige cultuur vereist.
Volwassen rat-CMs zijn robuust genoeg voor eencellige isolatie en cultuur op lange termijn in een in vitrosysteem10,11,12. Echter, volwassen muis CMs zijn van groot belang voor in vitro testen, als gevolg van de beschikbaarheid van een verscheidenheid van genetisch gemodificeerde muis modellen, die het mogelijk maakt voor het ontwerp en de uitvoering van verschillende innovatieve analyses die niet mogelijk zijn met rat CM13. In tegenstelling tot volwassen rat CM isolatie, is het heel uitdagend om een eencellige suspensie te verkrijgen van volwassen muis harten, en de lange termijn cultuur van volwassen muis CMs in de cultuur is nog uitdagender.
Volwassen CM isolatie van muis- en rattenharten met behulp van een Langendorff-systeem is eerder opgezet om CM-functie5,14,,15te bestuderen . Hier hebben we in detail de protocollen beschreven voor volwassen CM-isolatie van zowel ratten als muizen, evenals een gewijzigde langetermijncultuur, transfectie en CM-proliferatie van geïsoleerde cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er is een kritische behoefte om een protocol voor volwassen cardiomyocyten isolatie en cultuur op lange termijn vast te stellen om celspecifieke mechanistische studies uit te voeren. Er zijn slechts een paar rapporten over volwassen CM isolatie protocollen, en nog minder van hen worden gebruikt voor de lange termijn cultuur van volwassen muizen CM15,16,17. Aangetoond wordt dat de volwassen rat CM een hogere tolerantie heeft voor…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door financiering van het Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Cincinnati, College of Medicine, aan Dr. Onur Kanisicak; een subsidie van de National Institutes of Health (R01HL148598) aan Dr. Onur Kanisicak. Dr. Onur Kanisicak wordt ondersteund door de American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Dr. Perwez Alam wordt ondersteund door de Postdoctorale subsidie van de American Heart Association (AHA_20POST35200267). Dr. Malina J. Ivey wordt ondersteund door een NIH T32-subsidie (HL 125204-06A1).
Materials
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
Referencias
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8, 53748 (2013).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138, 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).
- Brette, F., Orchard, C. T-tubule function in mammalian cardiac myocytes. Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).
- Zhou, H., et al. Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).
- Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental. BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).
- Alam, P., et al. Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).
- Arif, M., et al. MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119, 909-920 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).
- O’Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).
- Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, 305-313 (1994).
