该协议旨在自动化数百个微生物细胞上的自动对焦M测量。首先,微生物固定在PDMS标记显微结构中,然后在数百个固定细胞上自动进行力光谱测量。
本文介绍的方法旨在自动化生物-AFM实验和力曲线记录。使用此方法,可以自动在 4 小时内记录 1000 个单元上的力曲线。为了保持 4 小时的分析时间,每个单元格的力曲线数减少到 9 或 16。该方法结合了基于 Jython 的程序和在定义模式上组装单元的策略。该计划在商用 Bio-AFM 上实施,可以将尖端集中在阵列的第一个单元格上,然后自动从单元格移动到单元格,同时记录每个单元格上的力曲线。使用这种方法,可以访问细胞的生物物理参数,如其刚性、粘合特性等。通过自动化和分析大量的细胞,可以访问细胞群的行为。这是生物-AFM领域的一个突破,迄今为止,数据只记录在几十个细胞上。
这项工作提供了一种方法,使用原子力显微镜(AFM)对数百个活细胞进行自动力测量。它还提供了一种在 PDMS 微结构盖章上固定微生物的方法,该印章与在液体环境中进行的 AFM 实验相容。
Bio-AFM 是一种高度专业化的技术,用于生物学应用,然后用于研究活细胞。它需要一个训练有素的工程师,他能够分析当时的一个单元格。在这些条件下,可以分析的不同细胞数量相当小,典型的5到10个细胞在4-5小时内。然而,记录在单个细胞上的力测量量通常非常高,并且很容易达到1000。因此,目前对活细胞进行 AFM 力测量的范式是记录数百个力曲线 (FCs),但在数量有限的细胞上。
从统计学上讲,这种方法是值得怀疑的,并提出了样本的代表性问题。事实上,即使在这几个细胞上记录了数百次测量,也很难通过测量几个细胞来评估细胞群的异质性。然而,正是根据这一范式,生物物理学、微生物学和纳米医学1、2、3取得了重大进展。事实上,单细胞规模的纳米分析提供了关于细胞纳米力学、转膜蛋白组织或抗菌或抗癌药物4、5、6、7的作用机制的新信息。然而,最近对细胞进行的几次高通量生物力学测试已经出现8项,表明科学界对改变这一模式和获取细胞群异质性感兴趣。这些测试都依赖于微流体系统来变形细胞,并在压力下光学测量其变形,以间接测量其整体表面弹性8。然而,这些方法的一个重要问题是它们是单参数的:只有细胞弹性才能被探测到。此外,它们不允许测量附着细胞的机械参数,例如,这可能限制对非循环哺乳动物细胞或生物膜的研究。
涉及AFM的方法已经由S.舍林9 和M.法夫尔10的团队开发。在纤维素模式9上固定细胞,迫使单个细胞采取模式9的形状。然后,这个团队绘制了几个单元格的机械特性来定义平均数据,代表14到18个细胞。Farve等人进行的发展旨在通过将AFM罐头10平行来使测量结果倍化。据我们所知,这种多重方向的工作并没有导致对活细胞的测量。
Dujardin 团队提出的一个有趣的方法是提供一种自动化 AFM,能够识别细胞并在定制井底成像。虽然这种方法不允许分析大量的细胞,它允许自动测试每个井11的不同条件。
我们在这项工作中的目标是更加雄心勃勃,因为我们想要测量至少1000个细胞,以获得不是一个普通的细胞,而是相反,细胞之间的异质性。我们在这里开发的使用 AFM 访问细胞群异质性的战略基于对记录有限数量的力曲线的数百个细胞的分析。与记录有限数量的细胞上大量力曲线的”经典”方法相比,这种方法应被视为补充,因为它不提供相同的信息。事实上,虽然典型的方法允许人们探索单个细胞表面的异质性,使用我们的方法,我们能够访问整个细胞群的异质性。为了实现这一目标,我们结合了一种方法,将微生物(这里为酵母菌种 念珠菌)直接固定到PDMS微结构图章12的井中,并开发了一个原始程序,自动将AFM尖端从细胞移动到细胞13, 并测量每个细胞的机械特性。
这种方法提供的主要改进是在确定的时间内测量的细胞数量显著增加。对应项是减少每个单元格测量的点数。这意味着这种方法不是为提供单个细胞的详细分析而设计的。该方法仅适用于可安装在 PDMS 盖章井中的细胞。邮票是相当通用的,而它包含1.5 x 1.5 μm2 至6 x 6 μm2的井。仍然不可能固定杆菌或更大的细胞。邮票和毛细管对流沉积不能用来固定更大的哺乳动物细胞(长度约100?…
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢法国国家海洋和委员会(墨西哥)、法国外交部和巴黎大学13号的FONCYT,尽管国际合作经济合作组织-NORD项目为”纳米心绞痛诊断”,263337号(墨西哥)和MI5P02(法国)提供财政支持。AMR要感谢SIP-IPN通过第20195489号项目的财政支持。SPC 由 CONACYT(第 288029 号)和 IPN 的博士奖学金支持,通过合作协议获得双博士证书 (IPN-UPS)。ED和CFD是国家科学研究中心(CNRS)的研究人员。
AFM cantilever | Bruker AFM probes | MLCT | The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m |
AFM data analysis | JPK-Bruker | JPK Data processing version minimum 5.1.8 | Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount |
AFM Petri dishes | WPI | FluoroDish FD35-100 | The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
Atomic force Microscope (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II or III | the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage |
Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration) |
Code editor | Microsoft | Visual Studio Code version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
Cryobeads | IFU | CB12 | |
Dessicator/Degassing chamber | Fisherbrand | 15594635 | The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do. |
Petri dish heater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
Sodium acetate buffer pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months |
Statistical analysis language | https://www.r-project.org | R version 3.6.1 | R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment |
Statistical analysis software | https://rstudio.com | R studio version 1.1.463 | collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics |
Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set |
Yeast Peptone D Broth | Difco | 242820 | |
YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |