Automatisering van bio-atoomkrachtmicroscoopmetingen op honderden C. albicans-cellen
Summary
Dit protocol heeft als doel afm-metingen op honderden microbiële cellen te automatiseren. Eerst worden microben geïmmobiliseerd in PDMS-stempelmicrostructuren en vervolgens worden krachtspectroscopiemetingen automatisch uitgevoerd op honderden geïmmobiliseerde cellen.
Abstract
De in dit artikel gepresenteerde methode is gericht op het automatiseren van Bio-AFM experimenten en het registreren van krachtcurves. Met deze methode is het mogelijk om krachtencurven op 1000 cellen automatisch in 4 uur vast te leggen. Om een analysetijd van 4 uur te behouden, wordt het aantal krachtcurven per cel teruggebracht tot 9 of 16. De methode combineert een op Jython gebaseerd programma en een strategie voor het assembleren van cellen op gedefinieerde patronen. Het programma, geïmplementeerd op een commerciële Bio-AFM, kan de tip centreren op de eerste cel van de array en vervolgens automatisch van cel naar cel bewegen terwijl krachtcurves op elke cel worden opgenomen. Met behulp van deze methodologie is het mogelijk om toegang te krijgen tot de biofysische parameters van de cellen, zoals hun stijfheid, hun kleefeigenschappen, enz. Met de automatisering en het grote aantal geanalyseerde cellen heeft men toegang tot het gedrag van de celpopulatie. Dit is een doorbraak op het gebied van Bio-AFM, waar tot nu toe slechts enkele tientallen cellen gegevens zijn geregistreerd.
Introduction
Dit werk biedt een methodiek om met behulp van een atoomkrachtmicroscoop (AFM) automatische krachtmetingen uit te voeren op honderden levende cellen. Het biedt ook een methode om microben te immobiliseren op een PDMS-microgestructureerde stempel die compatibel is met AFM-experimenten die in een vloeibare omgeving worden uitgevoerd.
Bio-AFM is een zeer gespecialiseerde technologie die is ontworpen voor toepassingen in de biologie en vervolgens wordt gebruikt om levende cellen te bestuderen. Het vereist een getrainde ingenieur die één cel tegelijk kan analyseren. In deze omstandigheden is het aantal verschillende cellen dat kan worden geanalyseerd vrij klein, typisch 5 tot 10 cellen in 4-5 uur. De hoeveelheid krachtmetingen die op een enkele cel zijn geregistreerd, is echter meestal erg hoog en kan gemakkelijk 1000 bereiken. Het huidige paradigma van AFM-krachtmetingen op levende cellen is dus het registreren van honderden krachtcurven (FCs) maar op een beperkt aantal cellen.
Statistisch gezien is deze benadering twijfelachtig en roept de kwestie van de representativiteit van de steekproef op. Het is bijvoorbeeld moeilijk om de heterogeniteit van een celpopulatie te evalueren door slechts een paar cellen te meten, zelfs als er honderden metingen op deze paar cellen worden geregistreerd. Het is echter op basis van dit paradigma dat er grote vooruitgang is geboekt op het gebied van biofysica, microbiologie en nanogeneeskunde1,2,3. Inderdaad, nanometeranalyse op de schaal van enkele cellen heeft nieuwe informatie opgeleverd over cellulaire nanomechanica, over de organisatie van transmembrane-eiwitten of het werkingsmechanisme van antimicrobiële of antikankergeneesmiddelen4,5,6,7. Onlangs zijn echter verschillende biomechanische tests met hoge doorvoer op cellen naar voren gekomen8, waaruit blijkt dat de wetenschappelijke gemeenschap geïnteresseerd is in het veranderen van dit paradigma en toegang tot de heterogeniteit van de celpopulatie. Deze tests zijn allemaal gebaseerd op microfluïdische systemen om cellen te vervormen en optisch hun vervorming onder spanning te meten om een indirecte meting van hun totale oppervlakteelasticiteit te verkrijgen8. Een belangrijk probleem met deze methoden is echter dat ze monoparametrisch zijn: alleen celelasticiteit kan worden onderzocht. Bovendien staan ze het meten van de mechanische parameters van aanhangende cellen niet toe, wat beperkend kan zijn voor de studies van niet-circulerende zoogdiercellen of biofilms bijvoorbeeld.
Door de teams van S. Scheuring9 en M. Favre10zijn benaderingen met afm ontwikkeld. Scheuring et al. geïmmobiliseerde cellen op fibronectinepatronen9, waardoor individuele cellen de vorm van het patroon moesten aannemen9. Vervolgens bracht dit team de mechanische eigenschappen van een paar cellen in kaart om gemiddelde gegevens te definiëren, representatief voor 14 tot 18 cellen. De door Farve c.s. uitgevoerde ontwikkeling was gericht op het multiplexen van de metingen door parallel te lopen met de AFM-vrijdragende10. Voor zover wij weten heeft dit werk in de multiplexing richting niet geleid tot metingen op levende cellen.
Een interessante aanpak voorgesteld door het team van Dujardin presenteert een geautomatiseerde AFM die cellen kan identificeren en in beeld kan brengen aan de onderkant van op maat gemaakte putten. Hoewel deze methode geen analyse van een grote populatie cellen mogelijk maakt, maakt het het mogelijk om automatisch verschillende omstandigheden in elke put te testen11.
Ons doel in dit werk is ambitieuzer, omdat we ten minste 1000 cellen wilden meten om toegang te krijgen tot geen gemiddelde cel, maar integendeel de heterogeniteit tussen cellen. De strategie die we hier hebben ontwikkeld om toegang te krijgen tot celpopulatie heterogeniteit met behulp van AFM is gebaseerd op de analyse van honderden cellen waarop een beperkt aantal krachtcurves wordt geregistreerd. In vergelijking met de “klassieke” benadering van het registreren van een groot aantal krachtcurven op een beperkt aantal cellen, moet deze benadering als complementair worden beschouwd, aangezien deze niet dezelfde informatie verschaft. Inderdaad, hoewel de typische methode het mogelijk maakt om individuele celoppervlak heterogeniteit te onderzoeken, met behulp van onze aanpak, zijn we in staat om toegang te krijgen tot de volledige celpopulatie heterogeniteit. Om dit doel te bereiken, hebben we een methode gecombineerd die microben (hier de gistsoort Candida albicans) direct immobiliseert in de putten van een PDMS microgestructureerde stempel12, en ontwikkelt een origineel programma voor het automatisch verplaatsen van de AFM-tip van cel naar cel13 en het meten van de mechanische eigenschappen van elke cel.
Protocol
Representative Results
Discussion
De belangrijkste verbetering van deze methodologie is een significante toename van het aantal gemeten cellen in een bepaalde hoeveelheid tijd. De tegenwaarde is een vermindering van het aantal gemeten punten per cel. Het betekent dat deze methode niet is ontworpen om een gedetailleerde analyse van een enkele cel te bieden. De methode is alleen van toepassing op cellen die in de putten van de PDMS-stempel passen. De stempel is vrij veelzijdig, terwijl het putten van 1,5 x 1,5 μm2 tot 6 x 6 μm2bevat…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen FONCYCYT van CONACYT (Mexico), het ministerie van Buitenlandse Zaken van Frankrijk en de Université Paris 13 erkennen, hoewel de financiële steun van het internationale samenwerkingsproject ECOS-NORD genaamd Nano-palpation for diagnosis, nr. 263337 (Mexico) en MI5P02 (Frankrijk). AMR wil de financiële steun van SIP-IPN via het project No. 20195489 bedanken. SPC wordt ondersteund door een PhD fellowship van CONACYT (No. 288029) en IPN via de cotutelle overeenkomst om een dubbel PhD certificaat (IPN-UPS) te behalen. ED en CFD zijn onderzoekers van Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).
Materials
| AFM cantilever | Bruker AFM probes | MLCT | The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m |
| AFM data analysis | JPK-Bruker | JPK Data processing version minimum 5.1.8 | Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount |
| AFM Petri dishes | WPI | FluoroDish FD35-100 | The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Atomic force Microscope (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II or III | the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration) |
| Code editor | Microsoft | Visual Studio Code version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Dessicator/Degassing chamber | Fisherbrand | 15594635 | The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do. |
| Petri dish heater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Sodium acetate buffer pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months |
| Statistical analysis language | https://www.r-project.org | R version 3.6.1 | R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment |
| Statistical analysis software | https://rstudio.com | R studio version 1.1.463 | collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set |
| Yeast Peptone D Broth | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
Referencias
- Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
- Dague, E., et al. Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Dague, E. Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells. Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).
- Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells. Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).
- Formosa, C., et al. Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain. Scientific Reports. 2, (2012).
- Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, &. #. 2. 0. 1. ;. Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).
- Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
- Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales. ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).
- Favre, M., et al. Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology. Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).
- Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications. PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).
- Formosa, C., et al. Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies. Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).
- Proa-Coronado, S., Séverac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells. Nanoscale Horizons. , (2019).
- Foncy, J., et al. Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography. Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).
- Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).
- Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
- Formosa, C., et al. Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).
- El-Kirat-Chatel, S., et al. Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans. Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).
- Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy. Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).
