Automazione delle misurazioni del microscopio a forza bio-atomica su centinaia di cellule C. albicans
Summary
Questo protocollo mira ad automatizzare le misurazioni AFM su centinaia di cellule microbiche. In primo luogo, i microbi vengono immobilizzati nelle microstrutture di francobolli PDMS e quindi le misurazioni della spettroscopia di forza vengono eseguite automaticamente su centinaia di cellule immobilizzate.
Abstract
Il metodo presentato in questo documento mira ad automatizzare gli esperimenti Bio-AFM e la registrazione delle curve di forza. Utilizzando questo metodo, è possibile registrare automaticamente le curve di forza su 1000 celle in 4 ore. Per mantenere un tempo di analisi di 4 ore, il numero di curve di forza per cella viene ridotto a 9 o 16. Il metodo combina un programma basato su Jython e una strategia per assemblare celle su modelli definiti. Il programma, implementato su un Bio-AFM commerciale, può centrare la punta sulla prima cella dell’array e quindi spostarsi, automaticamente, da cella a cella durante la registrazione delle curve di forza su ogni cella. Utilizzando questa metodologia, è possibile accedere ai parametri biofisici delle cellule come la loro rigidità, le loro proprietà adesive, ecc. Con l’automazione e il gran numero di celle analizzate, si può accedere al comportamento della popolazione cellulare. Si tratta di una svolta nel campo bio-AFM, dove finora sono stati registrati dati solo su poche decine di cellule.
Introduction
Questo lavoro fornisce una metodologia per eseguire misurazioni automatiche della forza su centinaia di cellule viventi utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM). Fornisce anche un metodo per immobilizzare i microbi su un timbro microstrutturato PDMS compatibile con gli esperimenti AFM condotti in un ambiente liquido.
Bio-AFM è una tecnologia altamente specializzata concepita per applicazioni in biologia e poi utilizzata per studiare le cellule viventi. Richiede un ingegnere addestrato in grado di analizzare una cella alla volta. In queste condizioni, il numero di cellule diverse che possono essere analizzate è piuttosto piccolo, tipico da 5 a 10 cellule in 4-5 ore. Tuttavia, la quantità di misurazioni della forza registrate su una singola cella è solitamente molto alta e può facilmente raggiungere 1000. Pertanto, l’attuale paradigma delle misurazioni della forza AFM sulle cellule viventi è registrare centinaia di curve di forza (HC) ma su un numero limitato di cellule.
Statisticamente, questo approccio è discutibile e solleva la questione della rappresentatività del campione. In effetti, è difficile, ad esempio, valutare l’eterogeneità di una popolazione cellulare misurando solo poche cellule, anche se su queste poche cellule vengono registrate centinaia di misurazioni. Tuttavia, è sulla base di questo paradigma che sono stati fatti importanti progressi in biofisica, microbiologia e nanomedicina1,2,3. Infatti, l’analisi nanometrica su scala di singole cellule ha fornito nuove informazioni sulla nanomeccanica cellulare, sull’organizzazione delle proteine transmembrana, o sul meccanismo d’azione dei farmaci antimicrobici o anticancro4,5,6,7. Recentemente, tuttavia, sono emersi diversi test biomeccanici ad alta produttività condottisu cellule 8, che mostrano l’interesse della comunità scientifica a cambiare questo paradigma e ad accedere all’eterogeneità della popolazione cellulare. Tutti questi test si basano su sistemi microfluidici per deformare le cellule e misurarne otticamente la deformazione sotto stress per ottenere una misura indiretta della loro elasticità superficialecomplessiva 8. Tuttavia, una questione importante con questi metodi è che sono mono-parametrici: solo l’elasticità cellulare può essere sondata. Inoltre, non consentono la misurazione dei parametri meccanici delle cellule aderenti, che possono essere limitanti per gli studi di cellule di mammifero non circolanti o biofilm, ad esempio.
Gli approcci che coinvolgono AFM sono stati sviluppati dai team di S. Scheuring9 e M. Favre10. cellule immobilizzate su modelli di fibronectina9,costringendo le singole cellule a prendere la forma del modello9. Quindi questo team ha mappato le proprietà meccaniche di alcune celle per definire i dati medi, rappresentativi da 14 a 18 celle. Lo sviluppo effettuato da Farve et al. Per quanto ne siamo a conoscenza, questo lavoro nella direzione del multiplexing non ha portato a misurazioni su cellule viventi.
Un approccio interessante proposto dal team di Dujardin presenta un AFM automatizzato in grado di identificare le cellule e di identificarle nella parte inferiore di pozzi su misura. Sebbene questo metodo non consenta l’analisi di una grande popolazione di cellule, consente il test automatico di condizioni diverse in ogni pozzo11.
Il nostro obiettivo in questo lavoro è più ambizioso poiché volevamo misurare almeno 1000 cellule per accedere non a una cellula media, ma, al contrario, all’eterogeneità tra le cellule. La strategia che abbiamo sviluppato qui per accedere all’eterogeneità della popolazione cellulare usando AFM si basa sull’analisi di centinaia di cellule su cui viene registrato un numero limitato di curve di forza. Rispetto all’approccio “classico” di registrare un gran numero di curve di forza su un numero limitato di celle, questo approccio dovrebbe essere considerato complementare in quanto non fornisce le stesse informazioni. Infatti, mentre il metodo tipico consente di sondare l’eterogeneità della superficie cellulare individuale, utilizzando il nostro approccio, siamo in grado di accedere all’intera eterogeneità della popolazione cellulare. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo combinato un metodo che immobilizza direttamente i microbi (qui la specie di lievito Candida albicans)nei pozzi di un timbro microstrutturato PDMS12, esviluppa un programma originale per spostare la punta AFM, automaticamente, dalla cella allacella 13 e misurare le proprietà meccaniche di ogni cellula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il principale miglioramento fornito da questa metodologia è un aumento significativo del numero di cellule misurate in un determinato lasso di tempo. La controparte è una riduzione del numero di punti misurati per cella. Significa che questo metodo non è progettato per fornire un’analisi dettagliata di una singola cella. Il metodo si applica solo alle celle che possono essere adatte ai pozzi del timbro PDMS. Il timbro è abbastanza versatile, mentre contiene pozzi di 1,5 x 1,5 μm2 fino a 6 x 6 μm2</s…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vogliamo riconoscere FONCYCYT di CONACYT (Messico), il Ministero degli Affari Esteri della Francia e l’Université Paris 13, anche se il supporto finanziario del progetto collaborativo internazionale ECOS-NORD ha nominato Nano-palpazione per la diagnosi, n. 263337 (Messico) e MI5P02 (Francia). AMR desidera ringraziare il sostegno finanziario di SIP-IPN attraverso il progetto n. 20195489. SPC è supportata da una borsa di dottorato di CONACYT (n. 288029) e IPN attraverso l’accordo cotutelle per ottenere un doppio certificato di dottorato (IPN-UPS). ED e CFD sono ricercatori del Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).
Materials
| AFM cantilever | Bruker AFM probes | MLCT | The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m |
| AFM data analysis | JPK-Bruker | JPK Data processing version minimum 5.1.8 | Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount |
| AFM Petri dishes | WPI | FluoroDish FD35-100 | The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Atomic force Microscope (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II or III | the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration) |
| Code editor | Microsoft | Visual Studio Code version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Dessicator/Degassing chamber | Fisherbrand | 15594635 | The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do. |
| Petri dish heater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Sodium acetate buffer pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months |
| Statistical analysis language | https://www.r-project.org | R version 3.6.1 | R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment |
| Statistical analysis software | https://rstudio.com | R studio version 1.1.463 | collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set |
| Yeast Peptone D Broth | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
Referencias
- Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
- Dague, E., et al. Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Dague, E. Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells. Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).
- Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells. Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).
- Formosa, C., et al. Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain. Scientific Reports. 2, (2012).
- Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, &. #. 2. 0. 1. ;. Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).
- Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
- Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales. ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).
- Favre, M., et al. Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology. Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).
- Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications. PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).
- Formosa, C., et al. Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies. Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).
- Proa-Coronado, S., Séverac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells. Nanoscale Horizons. , (2019).
- Foncy, J., et al. Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography. Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).
- Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).
- Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
- Formosa, C., et al. Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).
- El-Kirat-Chatel, S., et al. Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans. Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).
- Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy. Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).
