Yüzlerce C. albicans Hücresinde Biyo-Atomik Kuvvet Mikroskop Ölçümlerinin Otomasyonu
Summary
Bu protokol, yüzlerce mikrobiyal hücre üzerinde AFM ölçümlerini otomatikleştirmeyi amaçlamaktadır. İlk olarak, mikroplar PDMS damga mikroyaplarına hareketsiz hale getirilir ve daha sonra yüzlerce hareketsiz hücre üzerinde kuvvet spektroskopisi ölçümleri otomatik olarak yapılır.
Abstract
Bu makalede sunulan yöntem, Bio-AFM deneylerini ve kuvvet eğrilerinin kaydedilini otomatikleştirmeyi amaçlamaktadır. Bu yöntemi kullanarak, kuvvetleri 1000 hücreye otomatik olarak 4 saatte kaydetmek mümkündür. 4 saatlik analiz süresini korumak için hücre başına kuvvet eğrisi sayısı 9 veya 16’ya düşürülür. Yöntem, Jython tabanlı bir programı ve tanımlanmış desenler üzerinde hücreleri birleştirmek için bir stratejiyi birleştirir. Ticari bir Bio-AFM üzerinde uygulanan program, ucu dizinin ilk hücresine ortalayabilir ve ardından her hücrede kuvvet eğrileri kaydederken otomatik olarak hücreden hücreye hareket edebilir. Bu metodolojiyi kullanarak, hücrelerin sertlikleri, yapışkan özellikleri vb. Otomasyon ve analiz edilen çok sayıda hücre ile hücre popülasyonunun davranışına erişilebilir. Bu, biyo-AFM alanında şimdiye kadar verilerin sadece birkaç on hücreye kaydedildiği bir atılımdır.
Introduction
Bu çalışma, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak yüzlerce canlı hücre üzerinde otomatik kuvvet ölçümleri yapmak için bir metodoloji sağlar. Ayrıca, sıvı bir ortamda yapılan AFM deneyleriyle uyumlu bir PDMS mikro yapılandırılmış damga üzerindeki mikropları hareketsiz hale getirmek için bir yöntem sağlar.
Bio-AFM, biyolojideki uygulamalar için tasarlanmış ve daha sonra canlı hücreleri incelemek için kullanılan son derece uzmanlaşmış bir teknolojidir. O anda bir hücreyi analiz edebilecek eğitimli bir mühendise ihtiyaç var. Bu koşullarda, analiz edilebilen farklı hücrelerin sayısı oldukça küçüktür, tipik 5 ila 10 hücre 4-5 saat içinde. Bununla birlikte, tek bir hücrede kaydedilen kuvvet ölçümlerinin miktarı genellikle çok yüksektir ve kolayca 1000’e ulaşabilir. Bu nedenle, AFM kuvvet ölçümlerinin canlı hücreler üzerindeki mevcut paradigması, yüzlerce kuvvet eğrisini (FC) ancak sınırlı sayıda hücre üzerinde kaydetmektir.
İstatistiksel olarak, bu yaklaşım şüphelidir ve örneğin temsili konusunu gündeme getirmektedir. Aslında, örneğin, bu birkaç hücreye yüzlerce ölçüm kaydedilse bile, sadece birkaç hücreyi ölçerek bir hücre popülasyonunun heterojenliğini değerlendirmek zordur. Bununla birlikte, bu paradigma temelinde biyofizik, mikrobiyoloji ve nanotıp 1 ,2,3‘te büyük ilerlemeler yapılmıştır. Gerçekten de, tek hücre ölçeğinde nanometre analizi hücresel nanomekanik, transmembran proteinlerinin organizasyonu veya antimikrobiyal veya antikanser ilaçların etki mekanizması hakkında yeni bilgiler sağlamıştır4,5,6,7. Bununla birlikte, son zamanlarda, hücreler üzerinde yapılan birkaç yüksek verimli biyomekanik test ortaya çıkmıştır8Bilimsel topluluğun bu paradigmayı değiştirmeye ve hücre popülasyonu heterojenliğine erişmeye olan ilgisini gösteren. Bu testlerin tümü, hücreleri deforme etmek ve genel yüzey elastikiyetlerinin dolaylı bir ölçüsünü elde etmek için stres altındaki deformasyonlarını optik olarak ölçmek için mikroakışkan sistemlere dayanır8. Bununla birlikte, bu yöntemlerle ilgili önemli bir sorun mono-parametrik olmalarıdır: sadece hücre esnekliği araştırılabilir. Ayrıca, örneğin memeli hücrelerinin veya biyofilmlerin sirkülasyonsuz çalışmaları için sınırlayıcı olabilen yapışık hücrelerin mekanik parametrelerinin ölçülmesine izin vermezler.
AFM’yi içeren yaklaşımlar S. Scheuring9 ve M. Favre10ekipleri tarafından geliştirilmiştir. Scheuring ve ark. fibronektin desenleri üzerinde hareketsiz hücreler9, tek tek hücreleri desen şeklini almaya zorlamak9. Daha sonra bu ekip, ortalama verileri tanımlamak için birkaç hücrenin mekanik özelliklerini haritaladı, 14 ila 18 hücreyi temsil etti. AfM cantilevers10paralelleştirerek ölçümleri çoklamayı amaçlayan Farve ve ark. Bilgimize göre, çoklama yönünde yapılan bu çalışma canlı hücreler üzerinde ölçümlere yol etmemektedir.
Dujardin’in ekibi tarafından önerilen ilginç bir yaklaşım, hücreleri tanımlayabilen ve özel yapım kuyuların dibinde görüntüleyebilen otomatik bir AFM sunar. Bu yöntem büyük bir hücre popülasyonunun analizine izin vermese de, her kuyuda farklı koşulların otomatik olarak testine izin verir11.
Ortalama bir hücreye değil, aksine hücreler arasındaki heterojenliğe erişmek için en az 1000 hücreyi ölçmek istediğimiz için bu çalışmadaki hedefimiz daha iddialı. Burada AFM kullanarak hücre popülasyon heterojenliğine erişmek için geliştirdiğimiz strateji, sınırlı sayıda kuvvet eğrisinin kaydedildiği yüzlerce hücrenin analizine dayanmaktadır. Sınırlı sayıda hücre üzerinde çok sayıda kuvvet eğrisi kaydetmenin “klasik” yaklaşımı ile karşılaştırıldığında, aynı bilgileri sağlamadığı için bu yaklaşım tamamlayıcı olarak düşünülmelidir. Gerçekten de, tipik yöntem, yaklaşımımızı kullanarak, bireysel hücre yüzeyi heterojenliğini araştırmamıza izin verirken, tüm hücre popülasyonu heterojenliğine erişebiliyoruz. Bu amaca ulaşmak için, mikropları (burada maya türü Candida albicans)doğrudan bir PDMS mikro yapılandırılmış damga12kuyularına indiren ve AFM ucunu otomatik olarak hücreden hücre13’e taşımak ve her hücrenin mekanik özelliklerini ölçmek için orijinal bir program geliştiren bir yöntem geliştirdik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu metodolojinin sağladığı temel gelişme, ölçülen hücrelerin sayısında belirlenen sürede önemli bir artıştır. Muadili, hücre başına ölçülen puan sayısının azaltılmasıdır. Bu yöntemin tek bir hücrenin ayrıntılı bir analizini sağlamak için tasarlanmadığı anlamına gelir. Yöntem yalnızca PDMS damgasının kuyularına sığabilen hücreler için geçerlidir. Damga oldukça çok yönlüdür, 1.5 x 1.5 μm 2 ila 6 x6 μm2kuyular içerir. Yine de basili veya çok dah…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Conacyt (Meksika), Fransa Dışişleri Bakanlığı ve Université Paris 13’ün FONCYCYT’ini kabul etmek istiyoruz, ancak tanı için Nano palpation adlı uluslararası işbirlikçi ECOS-NORD projesinin finansal desteği, 263337 Numara (Meksika) ve MI5P02 (Fransa). AMR, 20195489 No’yla SIP-IPN’nin finansal desteğine teşekkür eder. SPC, çift doktora sertifikası (IPN-UPS) almak için cotutelle anlaşması aracılığıyla CONACYT (No. 288029) ve IPN’den bir doktora bursu ile desteklenmektedir. ED ve CFD, Centre National de la Recherche Scientifique’de (CNRS) araştırmacıdır.
Materials
| AFM cantilever | Bruker AFM probes | MLCT | The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m |
| AFM data analysis | JPK-Bruker | JPK Data processing version minimum 5.1.8 | Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount |
| AFM Petri dishes | WPI | FluoroDish FD35-100 | The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Atomic force Microscope (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II or III | the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration) |
| Code editor | Microsoft | Visual Studio Code version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Dessicator/Degassing chamber | Fisherbrand | 15594635 | The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do. |
| Petri dish heater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Sodium acetate buffer pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months |
| Statistical analysis language | https://www.r-project.org | R version 3.6.1 | R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment |
| Statistical analysis software | https://rstudio.com | R studio version 1.1.463 | collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set |
| Yeast Peptone D Broth | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
Referencias
- Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
- Dague, E., et al. Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Dague, E. Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells. Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).
- Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells. Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).
- Formosa, C., et al. Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain. Scientific Reports. 2, (2012).
- Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, &. #. 2. 0. 1. ;. Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).
- Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
- Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales. ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).
- Favre, M., et al. Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology. Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).
- Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications. PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).
- Formosa, C., et al. Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies. Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).
- Proa-Coronado, S., Séverac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells. Nanoscale Horizons. , (2019).
- Foncy, J., et al. Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography. Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).
- Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).
- Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
- Formosa, C., et al. Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).
- El-Kirat-Chatel, S., et al. Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans. Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).
- Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy. Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).
