Automatización De Las Mediciones De Microscopio De Fuerza Bio-Atómica En Cientos De Células De C. albicans
Summary
Este protocolo tiene como objetivo automatizar las mediciones de AFM en cientos de células microbianas. En primer lugar, los microbios se inmovilizan en microestructuras de sello PDMS y luego las mediciones de espectroscopia de fuerza se realizan automáticamente en cientos de células inmovilizadas.
Abstract
El método presentado en este trabajo tiene como objetivo automatizar los experimentos bio-AFM y el registro de curvas de fuerza. Usando este método, es posible registrar curvas de fuerzas en 1000 celdas en 4 horas automáticamente. Para mantener un tiempo de análisis de 4 horas, el número de curvas de fuerza por celda se reduce a 9 o 16. El método combina un programa basado en Jython y una estrategia para ensamblar células en patrones definidos. El programa, implementado en un Bio-AFM comercial, puede centrar la punta en la primera celda de la matriz y luego moverse, automáticamente, de una celda a otra mientras registra las curvas de fuerza en cada celda. Utilizando esta metodología, es posible acceder a los parámetros biofísicos de las células como su rigidez, sus propiedades adhesivas, etc. Con la automatización y el gran número de células analizadas, se puede acceder al comportamiento de la población celular. Este es un gran avance en el campo Bio-AFM donde los datos, hasta ahora, se han registrado en sólo unas pocas decenas de células.
Introduction
Este trabajo proporciona una metodología para realizar mediciones automáticas de fuerza en cientos de células vivas utilizando un microscopio de fuerza atómica (AFM). También proporciona un método para inmovilizar microbios en un sello microestructurado PDMS que es compatible con experimentos AFM realizados en un entorno líquido.
Bio-AFM es una tecnología altamente especializada concebida para aplicaciones en biología y luego utilizada para estudiar células vivas. Se requiere un ingeniero capacitado que pueda analizar una célula en ese momento. En estas condiciones, el número de células diferentes que se pueden analizar es bastante pequeño, típico de 5 a 10 células en 4-5 horas. Sin embargo, la cantidad de mediciones de fuerza registradas en una sola celda suelen ser muy altas y pueden llegar fácilmente a 1000. Por lo tanto, el paradigma actual de las mediciones de fuerza AFM en células vivas es registrar cientos de curvas de fuerza (FCs) pero en un número limitado de células.
Estadísticamente, este enfoque es cuestionable y plantea la cuestión de la representatividad de la muestra. De hecho, es difícil, por ejemplo, evaluar la heterogeneidad de una población celular midiendo sólo unas pocas células, incluso si se registran cientos de mediciones en estas pocas células. Sin embargo, es sobre la base de este paradigma que se han realizado importantes avances en biofísica, microbiología y nanomedicina1,2,3. De hecho, el análisis nanométrico a escala de células individuales ha proporcionado nueva información sobre la nanomecánica celular, sobre la organización de las proteínas transmembrana, o el mecanismo de acción de los fármacos antimicrobianos o anticancerígenos4,5,6,7. Sin embargo, recientemente han surgido varias pruebas biomecánicas de alto rendimiento realizadas en células8,mostrando el interés de la comunidad científica en cambiar este paradigma y acceder a la heterogeneidad de la población celular. Todos estos ensayos se basan en sistemas microfluídicos para deformar las células y medir ópticamente su deformación bajo tensión para obtener una medida indirecta de su elasticidad superficial global8. Sin embargo, un problema importante con estos métodos es que son mono-paramétricos: sólo la elasticidad celular puede ser sondeada. Además, no permiten la medición de los parámetros mecánicos de las células adherentes, lo que puede ser limitante para los estudios de células de mamíferos no circulantes o biopelículas, por ejemplo.
Los enfoques que involucran AFM han sido desarrollados por los equipos de S. Scheuring9 y M. Favre10. Células inmovilizadas de Scheuring et al. en patrones de fibronectina9, obligando a las células individuales a tomar la forma del patrón9. Luego, este equipo mapeó las propiedades mecánicas de unas pocas celdas para definir datos promedio, representativos de 14 a 18 celdas. El desarrollo llevado a cabo por Farve et al. tuvo como objetivo multiplexar las mediciones mediante la paralelización de los voladizos AFM10. A nuestro conocimiento, este trabajo en la dirección de multiplexación no ha llevado a las medidas en células vivas.
Un enfoque interesante propuesto por el equipo de Dujardin presenta un AFM automatizado capaz de identificar células y realizar imágenes de ellas en el fondo de pozos hechos a medida. Aunque este método no permite el análisis de una gran población de células, permite la prueba automática de diferentes condiciones en cada pozo11.
Nuestro objetivo en este trabajo es más ambicioso ya que hemos querido medir al menos 1000 células para acceder no a una célula media, sino, por el contrario, a la heterogeneidad entre células. La estrategia que desarrollamos aquí para acceder a la heterogeneidad de la población celular utilizando AFM se basa en el análisis de cientos de células en las que se registra un número limitado de curvas de fuerza. En comparación con el enfoque “clásico” de registrar un gran número de curvas de fuerza en un número limitado de células, este enfoque debe considerarse complementario, ya que no proporciona la misma información. De hecho, mientras que el método típico permite sondear la heterogeneidad de la superficie celular individual, utilizando nuestro enfoque, podemos acceder a toda la heterogeneidad de la población celular. Para lograr este objetivo, hemos combinado un método que inmoviliza directamente los microbios (aquí la especie de levadura Candida albicans)en los pocillos de un sello microestructurado PDMS12,y desarrolla un programa original para mover la punta AFM, automáticamente, de célula a célula13 y medir las propiedades mecánicas de cada célula.
Protocol
Representative Results
Discussion
La principal mejora proporcionada por esta metodología es un aumento significativo en el número de células medidas en una cantidad determinada de tiempo. La contraparte es una reducción del número de puntos medidos por celda. Esto significa que este método no está diseñado para proporcionar un análisis detallado de una sola celda. El método sólo se aplica a las celdas que pueden caber en los pozos del sello PDMS. El sello es bastante versátil, mientras que contiene pozos de 1,5 x 1,5 μm2 hasta 6 x…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos reconocer a FONCYCYT de CONACYT (México), el ministerio de Relaciones Exteriores de Francia y la Universidad París 13, a través del apoyo financiero del proyecto colaborativo internacional ECOS-NORD llamado Nano-palpación para el diagnóstico, No. 263337 (México) y MI5P02 (Francia). AMR desea agradecer el apoyo financiero de SIP-IPN a través del proyecto No. 20195489. SPC es apoyado por una beca de doctorado de CONACYT (No. 288029) e IPN a través del acuerdo cotutelle para obtener doble certificado de doctorado (IPN-UPS). ED y CFD son investigadores del Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).
Materials
| AFM cantilever | Bruker AFM probes | MLCT | The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m |
| AFM data analysis | JPK-Bruker | JPK Data processing version minimum 5.1.8 | Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount |
| AFM Petri dishes | WPI | FluoroDish FD35-100 | The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Atomic force Microscope (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II or III | the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration) |
| Code editor | Microsoft | Visual Studio Code version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Dessicator/Degassing chamber | Fisherbrand | 15594635 | The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do. |
| Petri dish heater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Sodium acetate buffer pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months |
| Statistical analysis language | https://www.r-project.org | R version 3.6.1 | R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment |
| Statistical analysis software | https://rstudio.com | R studio version 1.1.463 | collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set |
| Yeast Peptone D Broth | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
Referencias
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