تطبيق Microdissection الليزر لكشف النسخ الإقليمية في أنسجة الكلى البشرية
Summary
نحن وصف بروتوكول للmicrodissection الليزر من أجزاء فرعية من الكلى البشرية، بما في ذلك كبيبات الكبيب، tubule القريب، سميكة صعود الطرف، وجمع القناة والتهائل. ثم يتم عزل الجيش الملكي النيبالي عن المقصورات التي تم الحصول عليها ويتم تنفيذ تسلسل الحمض النووي الريبي لتحديد التغييرات في التوقيع النسخي داخل كل جزء فرعي.
Abstract
تحليل التعبير الجيني للأنسجة الكلى البشرية هو أداة هامة لفهم التوازن والأمراض في الفيزيولوجيا. زيادة دقة وعمق هذه التكنولوجيا وتوسيعها إلى مستوى الخلايا داخل الأنسجة هناك حاجة. على الرغم من أن استخدام تسلسل الحمض النووي والرنا وحيد الخلية الواحد أصبح واسع الانتشار، فإن تواقيع التعبير للخلايا التي تم الحصول عليها من تفكك الأنسجة لا تحافظ على السياق المكاني. من شأن الميكروستيكشن بالليزر (LMD) القائم على علامات فلورية محددة أن يسمح بعزل هياكل محددة ومجموعات خلايا ذات أهمية مع التعريب المعروف، مما يسمح بالحصول على توقيعات مستنسخة ذات رسوخ مكانية في أنسجة الكلى. لقد قمنا بتحسين منهجية LMD ، مسترشدة بصبغة سريعة تستند إلى الفلورانس ، لعزل خمس مقصورات متميزة داخل الكلى البشرية وإجراء تسلسل الحمض النووي الريبي اللاحق من عينات أنسجة الكلى البشرية القيمة. كما نقدم معايير لمراقبة الجودة لتمكين تقييم مدى كفاية العينات التي تم جمعها. يُظهر سير العمل الموضح في هذه المخطوطة جدوى هذا النهج لعزل التوقيعات المستنسخة الجزئية الفرعية بثقة عالية. ويمكن أيضاً تطبيق النهج المنهجي المعروض هنا على أنواع الأنسجة الأخرى مع استبدال علامات الأجسام المضادة ذات الصلة.
Introduction
وقد تحسنت التطورات التكنولوجية في دراسة عينات الأنسجة فهم الحالة الصحية والمرض في مختلف الأجهزة. وقد أكدت هذه التطورات أن علم الأمراض يمكن أن تبدأ في مناطق محدودة أو في أنواع محددة من الخلايا، ولكن لها آثار هامة على الجهاز بأكمله. ولذلك ، في العصر الحالي من الطب الشخصي ، من المهم أن نفهم علم الأحياء على حد سواء الخلية والمستوى الإقليمي وليس فقط على الصعيد العالمي1. وينطبق هذا بشكل خاص على الكلى ، التي تتكون من خلايا وهياكل متخصصة مختلفة تبدأ و / أو تستجيب بشكل متمايز للإجهاد المرضي. لا يزال المرض من أنواع مختلفة من أمراض الكلى البشرية غير مفهومة جيدا. ومن ثم فإن توليد منهجية لدراسة التغيرات في التعبير الجيني في أجزاء أنبوبية محددة أو هياكل أو مناطق من التداخل في الكلى البشرية سيعزز القدرة على الكشف عن التغيرات المحددة في المنطقة التي يمكن أن تُعلم عن التسبب في المرض.
عينات خزعة الكلى البشرية هي مورد محدود وثمين. لذلك، ينبغي تحسين التقنيات استجواب transcriptomics في أنسجة الكلى إلى الاقتصاد في الأنسجة. وتشمل الطرق المتاحة لدراسة النسخ على مستوى الخلية والمستوى الإقليمي تسلسل RNA خلية واحدة (scRNaseq)، RNaseq النووية واحدة (snRNaseq)، في التهجين المكاني في الموقع، والصغرى الليزر (LMD). وهذا الأخير مناسب تماماً لعزل المناطق أو الهياكل ذات الاهتمام الدقيق داخل أقسام الأنسجة، لتسلسل الحمض النووي الريبي في المصبوتحليله 2و3و4و5. يمكن اعتماد LMD للاعتماد على تحديد أنواع أو هياكل محددة من الخلايا استنادًا إلى علامات معتمدة باستخدام التصوير القائم على الفلور أثناء التشريح.
وتشمل السمات الفريدة لتقنيات النسخ المجهرية بالليزر التي تساعد على ذلك: 1) الحفاظ على السياق المكاني للخلايا والهياكل، الذي يكمل تكنولوجيات الخلايا المفردة التي يتم فيها تحديد الخلايا بالتعبير وليس بالسنولوجيا؛ (2) الحفاظ على السياق المكاني للخلايا والهياكل؛ (2) الحفاظ على البيئة الجغرافية؛ (2) استخدام تكنولوجيات الخلايا المفردة؛ (2) الحفاظ على البيئة الجغرافية للخلايا والهياكل؛ (2) الحفاظ على الخلايا والهياكل؛ (2) الحفاظ على البيئة المكانية للخلايا والهياكل؛ (2) استخدام تكنولوجيات الخلايا الصغيرة التي يتم تحديدها باستخدامها في الهياكل المحددة؛ (2) الحفاظ على استخدام الخلايا الصغيرة في المناطق التي يتم فيها استخدام الخلايا الصغيرة في المناطق التي يتم فيها تحديدها باستخدامها في 2) التكنولوجيا بإعلام ويتم إبلاغها من قبل تقنيات التصوير الأخرى لأن علامة الأجسام المضادة يحدد توقيعات التعبير؛ 3) القدرة على تحديد الهياكل حتى عندما علامات تغيير في المرض؛ 4) الكشف عن المحاضر أعرب عن انخفاض في ما يقرب من 20،000 الجينات؛ و 5) اقتصاد الأنسجة ملحوظا. التكنولوجيا قابلة للتطوير إلى خزعة الكلى مع أقل من 100 μm سمك من نواة ضرورية للحصول على ما يكفي من RNA وتمكن من استخدام الأنسجة المجمدة المؤرشفة ، والتي تتوفر عادة في مستودعات كبيرة أو المراكز الأكاديمية6.
في العمل الذي أعقب ذلك، ونحن وصف التكنولوجيا النسخ الإقليمية والجملة بالتفصيل، الأمثل مع بروتوكول تلطيخ الفلوريسينس السريعة رواية للاستخدام مع أنسجة الكلى البشرية. هذا النهج يحسن على استكشافات LMD الكلاسيكية لأنه يوفر بيانات التعبير منفصلة للفصيلات الفرعية والنيفرون بدلا من التعبير توبولونترسالية الكلي. وتشمل هذه التدابير تدابير ضمان الجودة والرقابة التي تم تنفيذها لضمان الصرامة وقابلية التكرار. ويتيح البروتوكول تصور الخلايا والمناطق ذات الأهمية، مما يؤدي إلى الحصول على RNA بشكل مرض من هذه المناطق المعزولة للسماح بتسلسل الحمض النووي الريبي في المصب.
Protocol
Representative Results
Discussion
LMD المستندة إلى transcriptomics هي تقنية مفيدة التي ترسي التعبير الجيني لمناطق محددة داخل الأنسجة. وقد وصفت أساس هذه التكنولوجيا وتطبيقها المحتملة في الكلى سابقا8. ومع ذلك ، فإن التحسين والتحديث وتبسيط التشريح القائم على الفلور الذي يهدف على وجه التحديد إلى تشريح الدقة العالية لتسلس…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
عام: ويود المؤلفون أن يشكروا محققي مشروع طب دقة الكلى (www.kpmp.org) على دعمهم ونصائحهم الكريمة.
التمويل: وقد قدمت الدعم لهذا العمل المعاهد الوطنية للصحة/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.)؛ المعاهد القومية للصحة/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S. ). وقد تم دعم البحوث التي تم الإبلاغ عنها في هذه المخطوطة من قبل المعهد الوطني للسكري والجهاز الهضمي وطب أمراض الكلى (NIDDK) كلية الطب (KPMP)، (www.kpmp.org)، تحت رقم الجائزة U2CDK114886.
توافر البيانات والمواد: يتم أرشفة البيانات في التعبير الجيني Omnibus (GEO # معلقة)
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
Referencias
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett’s esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection. Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. Laser capture microdissection of kidney tissue. Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).
- Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
- . Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf (2016)
- Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis. Physiological Reports. 3 (2), (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).
- Hipp, J. D., et al. Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools. Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).
